1.过表达基因
基因过表达的基本原理：
是通过人工构建的方式在[目的基因]上游加入调控元件，使基因可以在人为控制的条件下实现大量转录和翻译，从而实现基因产物的过表达。
①细胞水平步骤
1，构建克隆。将目的基因连接在特定的载体上，载体种类依据表达系统差异而不同。在载体上一般含有增强基因转录的promoter
- 将克隆导入表达细胞中。在大肠杆菌，酵母和哺乳动物细胞中，构建的外源质粒直接导入细胞即可，这个过程称为转化或[转染，必要时可以采用病毒（腺病毒，慢病毒）
②转基因小鼠的构建
2.基因沉默技术
①RNAi：
即由与靶基因同源的双链RNA对于mRNA 特异性降解，从而使基因转录后沉默的现象。
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微RNA（microRNAs；miRNA，又译小分子RNA）是真核生物中广泛存在的一种长约21到23个核苷酸的RNA分子，可调节其他基因的表达。
miRNA来自一些从DNA转录而来，但无法进一步转译成蛋白质的RNA（属于非编码RNA）。miRNA通过与靶信使核糖核酸(mRNA)特异结合，可以降解mRNA或者阻遏其翻译,在动物中，一个微RNA通常可以调控数十个基因。
miRNA和siRNA的区别
1.根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。
2.结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。
3.Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。
4.在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3′-UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。
5.在作用方式上，miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。
6.miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。
②基因敲除
原理：
是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
同源重组.png
Ⅰ.Cre/LoxP系统
1）基本概念
Cre重组酶（Cyclization Recombination Enzyme）由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质。它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能够特异性识别loxP位点, 从而重组或删除Loxp片段间的基因
** LoxP**（locus of X-overP1）位点长为34bp，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。其中，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了loxP位点的方向。
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2)Cre/loxP系统基因重组原理
Cre/loxP系统存在以下几种诱导重组的方式：
当基因内存在loxP位点且有Cre重组酶存在时，Cre重组酶便会与loxP位点两端的反向重复序列区结合形成二聚体。此二聚体与其他loxP位点的二聚体结合，进而形成四聚体。随之，loxP位点之间的DNA序列被Cre重组酶切掉，切口通过DNA连接酶重新连接。DNA重组结果主要取决于loxP位点的方向及位置。
（1）两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶敲除（Deletion）loxP间的序列；
（2）两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反，Cre重组酶诱导loxP间的序列翻转（Inversion）；
（3）两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶诱导两条DNA链发生交换（Cassette change）或染色体易位（Translocation）。
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3)具体操作
应用Cre/loxP系统获取特定基因敲除小鼠
应用Cre／loxP系统实现体内某特定基因在特定条件下的敲除，需要两只转基因小鼠。
第一只小鼠一般采用胚胎干细胞技术获得，首先在体外构建一个在目的基因两端分别含有一个loxP位点的基因序列，之后将体外构建好的这段基因序列转入胚胎干细胞内，使其通过同源重组替代细胞基因组内原来的基因序列。经过这样处理的胚胎干细胞被重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育成为一个完整的胚胎，最终成为一只转基因小鼠。在这只转基因小鼠中，loxP位点被引入到相应基因的内含子内，理论上不会对相应基因的功能产生影响，因此一般情况下，该小鼠的表型是正常的。
第二只转基因小鼠一般采用卵母细胞注射或者胚胎干细胞技术获得，在这只小鼠中，Cre重组酶被置于某特定基因启动子（有ERT则需要卡莫西芬诱导，没有则不需要，看它在第多少天才有表型，比如P-CRE）的调控之下，可以使其在某特定的条件下表达。最后，让这两只小鼠进行交配，产生的同时含有上述两种基因型的子代小鼠就会在某一特定类型的细胞中缺失某一特定的基因
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（图源南模生物）
3.qPCR
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即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR。
原理：在qPCR中使用插入性DNA染料，随着PCR循环的连续进行，这种染料的荧光强度会不断增强，从而可以使人们对反应中的DNA进行定量。利用荧光信号的变化，实时监测PCR扩增反应中的每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值（PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。）和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
定量逆转录PCR（RT-qPCR）
①第一步：cDNA合成
RT-qPCR的第一步是将样本中提取的RNA逆转录为cDNA。这一步通常面临的问题包括：(1)模板仅有大约22个核苷酸，(2)成熟体miRNA、前体miRNA和初级转录物并存。
目前逆转录miRNA主要有两种方法：
使用不同miRNA的特异性引物进行逆转录
使用样本中所有miRNA的通用引物进行逆转录
②第二步：miRNA特异性引物设计
cDNA合成后，即可开始qPCR。在qPCR中需要使用合适的引物。目前常用的两种miRNA qPCR荧光染料为SYBR Green和双标记水解探针。
③第三步：内参RNA的选择与数据均一化
为通过real-time PCR达到准确、可重复的miRNA定量结果，需要采用合适的内源性参比miRNA对被测miRNA的量进行均一化。这一方法被称为相对定量。均一化能够避免不准确的定量结果，并且可实现不同实验和不同样本检测结果之间的直接比较。用于real-time PCR miRNA检测数据均一化化的理想内参RNA应满足以下要求：
研究所涉及的所有样本具有稳定的表达水平
大小与被测miRNA相似
表达水平与被测miRNA相似
在实验条件下表达水平不会被调控
内源性参比RNA和miRNA的引物应具有相似的扩增效率（接近100%）
4.蛋白免疫印迹（western blotting）
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5.流式
6.荧光素酶报告基因实验
miRNA 主要通过作用于靶基因的 3’UTR 起作用，可以将目的基因 3’UTR 区域构建至载体中报告基因 luciferase 的后面，通过比较过表达或者干扰 miRNA 后，报告基因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化）可以定量反映 miRNA 对目的基因的抑制作用，也即用荧光值来判断miRNA是否和靶基因结合。
可以极其灵敏、高效地检测基因的表达，是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。荧光素酶基因已成为目前运用最广泛的报告基因之一。
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