在介绍定量蛋白质组学非标记定量法研究蛋白互作的方法之前,小编得先给大家介绍一下蛋白-蛋白互作方法的研究背景。
蛋白互作方法的研究背景
要了解蛋白质在细胞内的功能,需要分析它们与其他分子之间的相互作用,包括与其他蛋白质的相互作用。虽然许多蛋白质-蛋白质相互作用基本上是组成性的,例如那些参与诸如核糖体等分子机制的组成间的相互作用,也有许多相互作用是以条件依赖的方式进行调节的,包括那些由翻译后修饰调节的相互作用。表征复杂的相互作用网络只需要对这些蛋白质进行鉴定,但获得相互作用组的动态视图则需要进行定量分析。
目前已有几种识别蛋白-蛋白质互作的方法。这些方法中,亲和标纯化(AP)以及基于报告表达或可视化的方法是最常见的。如其他文献所述,后者包括酵母双杂交法、基于融合头相互作用的蛋白质重组相关技术和两种蛋白质之间的荧光共振能量转移法(FRET)或生物发光共振能量转移法和(BRET)。然而,这些技术中只有少数能够以半定量或定量的方式监测动态调节的蛋白质-蛋白质互作。许多可用于探索蛋白质互作的动态性质的方法将亲和纯化与定量兼容的检测策略结合起来。
蛋白质定量和表达分析已经被应用了多年。免疫沉淀(酶联免疫吸附试验;ELISA)和免疫印迹(通常称为Western blotting)等技术一直以来被用于生物分子的定量。然而,基于抗体的测定需要开发针对目标生物分子的特异性抗体,这个过程既耗经费又耗时。此外,基于抗体的精准定量需要生产高质量试剂进行验证,使得过程变得更加漫长。对于每种形式的蛋白质(比如拼接变异体和翻译后修饰这种形式),生成对应的抗体库也是不切实际的,特别是在修饰形式不断增多的情况下。此外,尽管在多重抗体分析方面已经取得了重大进展,该方法对于可同时评估的蛋白质数量仍有明确的限制。这一点,再加上大量蛋白质仍然缺乏适当的抗体,意味着使用免疫沉淀或免疫印迹进行蛋白质网络水平的量化是远远不够的。除了这些问题外,还有血多其他与依赖抗体进行量化有关的问题。例如,与其他蛋白质的交叉反应(比如当抗体识别的表位未知时)也可能影响定量。在蛋白质-蛋白质相互作用研究中,抗体识别的表位可能与一个或多个蛋白质的结合位点重叠,从而导致低估蛋白质丰度和/或蛋白质相互作用的位移。
本文由百泰派克生物科技整理编辑。百泰派克生物科技专注于基于质谱的蛋白质组学服务,结合亲和纯化与定量蛋白质组学非标记定量Label Free、SILAC或SWATH定量技术,开发了一系列蛋白质组研究策略,其灵敏度高、重复性好,非常适合蛋白质相互作用的研究。
文献参考:Stephen Tate, Brett Larsen, Ron Bonner, Anne-Claude Gingras, Label-free quantitative proteomics trends for protein-protein interactions. Journal of Proteomics, 2013.
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