流式细胞术已成为分子生物学、医学、免疫学、病理学、植物生物学、海洋生物学等多个研究领域对荧光信号进行高速、灵敏分析的有效方法。仪器制造商已经开发出具有独立信号检测路径的多路激光(355 nm、405 nm、488 nm、561 nm等)流式细胞仪(FCM)。一系列更亮和光谱多样化的荧光染料，如用于紫色激光器的亮紫色TM染料已经被开发出来。那我们就盘点一下都有那些新兴的流式细胞仪。-光谱流式

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传统的流式细胞术是利用二向色镜和带通滤光片对发出的荧光进行分割和滤除，而频谱流式细胞术是一种检测单个细胞发出的荧光信号的新技术。这一新的光谱- FCM改进了光谱相邻的各种FPs(包括光转换FPs)和多色荧光染料的组合使用，不仅用于免疫系统的研究，而且用于其他研究和临床应用领域。

光谱流式细胞术是一种基于常规流式细胞术的技术，其中光谱仪和多通道检测器（通常为CCD）代替了常规系统中的传统反射镜，滤光器和光电倍增管（PMT）。流式细胞仪可以快速进行多参数收集并分析单个细胞或颗粒上的数据。

系列一、光谱流式原理

光谱设计和特征   Novel Full-Spectral Flow Cytometry with Multiple Spectrally-Adjacent Fluorescent Proteins and Fluorochromes and Visualization of In Vivo Cellular Movement, Koji Futamura,Cytometry Part A Published by Wiley Periodicals, Inc. on behalf of ISAC Principle of “Spectral Unmixing” and separation of fluoroprobes using in silico simulation. a) The spectral-FCM unmixing algorithm utilizes all the emitted fluorescence as basic spectrum patterns to separate different spectrums (upper). On the other hand, conventional compensation utilizes only a narrow band of light to remove overlapping fluorescence emissions (lower). b) Spectrum chart by 488 nm laser excitation of simulated data using FITC and PE (upper). Fluorescent chart of simulated data before spectral unmixing (lower). To help identifying each population, some populations are painted with different colors. c) Spectra of combinations of FITC/PE, APC/APCCy7, PerCP/PerCP-Cy5.5, and AcGFP/FITC, respectively (upper). Normalized intensity spectra of each fluorochrome are shown as the ordinate. The intensity values of PMT channels from 20th to 23rd are assigned as zero because these simulation data were generated in dual laser mode which needs physical masking from 20th to 23rd in order to brock 638 nm laser. Fluorescent charts of FITC/PE, APC/APC-Cy7, PerCP/PerCP-Cy5.5, and AcGFP/FITC combinations after applying LSM and WLSM algorithm, respectively (lower). To help identifying each population in dot plots, some populations are painted with different colors. d) Comparison of relative stain index under changing fluorescent intensity ratio of two fluoroprobes; FITC/PE, APC/APC-Cy7, PerCP/PerCP-Cy5.5, and AcGFP/FITC after applying LSM and WLSM. Relative stain index is calculated using population “A and B,” “A and C,” and “A and D,” respectively. Fluorescent ratio of second fluoroprobe divided by first fluoroprobe as the abscissa and relative stain index as the ordinate are indicated.

1.1   索尼发布旗舰级全光谱流式细胞分析仪ID7000™ ，以简便操作流程实现超40色分析

ID7000™ 旗舰级全光谱流式细胞分析仪

        日本东京-索尼公司（以下简称“索尼”）宣布推出旗舰级全光谱流式细胞分析仪ID7000™ ,以精简的操作流程实现同时超40色荧光的多色流式分析。ID7000™搭载索尼创新的全光谱技术，可配备多达7个激光²和188个检测器，允许研究者从混合细胞群体中检测微弱信号和稀有细胞群体，将当今细胞分析技术所能达到的边界大大拓展。详细参数可参考索尼官网 https://www.sony.com.cn/zh-cn/cms/newscenter/techonology/2019/FY2019-HQ-Technology-2.html

2.Cytek Northern Lights

Cytek® Northern Lights

        介绍：一个新的流式细胞仪系统，改变了科学家期望看到的性能范式，从一个负担得起的三激光系统。Cytek北极光采用了与它的姐姐Cytek极光相同的突破性技术。和Aurora一样，它的光学设计和非混合算法给了科学家们极大的灵活性，使他们能够在不为每个应用重新配置系统的情况下，使用大量新的荧光素组合。最先进的光学和低噪声电子提供了良好的灵敏度和分辨率。平行激光束剖面，结合独特设计的流体系统，转化为突出的性能在高样品流量。详细参数：https://cytekbio.com/pages/northern-lights#tab-overview

光谱流式小故事

流式细胞术从1参数技术转移到30参数技术已经花费了50年的时间。原因之一是硬件的复杂性。一个平均的12色流式细胞仪将包含12–14个独立的检测器和40多个光学滤镜。考虑当前的30荧光参数仪器的组件。需要32个独立的检测器（加上电源和前置放大器）以及大约50到60多个附加的光学组件-这仅在仪器的发射侧。如此复杂的仪器的庞大的尺寸，复杂性和制造成本是巨大的。现在可以购买具有50多个参数但价格约为一百万美元的商用流式细胞仪。问题是为什么许多制造商的持续发展方向都集中在传统的多色技术上，而在很大程度上已经过时了？当前的重点是旧的光电倍增管（PMT）技术，旧的过滤器技术，最糟糕的是，旧的补偿技术并未促进流式细胞仪技术的发展。还有一种替代方法可能会超出这些多色仪器的功能，而成本可能仅为其五分之一。

J. Paul Robinson 团队在2004年国际分析细胞学学会（现为细胞学进展学会）的大会上首次提出了功能性光谱流式细胞术15；然后，J. Paul Robinson在同年的光子学出版物中介绍了光谱流式，随后在2007 年向普渡大学授予了专利。当时，该方法的原理是使用连接到色散元件的32通道PMT阵列。硬件组件减少到只有几个光学元件和一个检测器阵列。向全世界，推广这项技术，并写了NIH赠款，以获取发展光谱流式细胞术技术的资金。

 2011年，索尼获得了普渡大学（Purdue University）的光谱技术专利许可，并致力于开发光谱流式细胞仪。在几年之内，一些出版物证明了> 10色光谱流式细胞术。光谱细胞术随后实现了超过20种颜色的流式细胞术，使用光谱解混具有出色的结果。确实，光谱流式细胞仪的真正目标是将我们的注意力从信号强度转移到光谱特征作为最重要的参数。长期以来，我们一直将“亮度”视为信号的最重要特征，因此我们忽略了频谱特征的力量。光谱流式细胞仪可以分析无法通过多色流式细胞仪充分分离的荧光染料，这一点非常相关。 

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参考资料：

1.Novel Full-Spectral Flow Cytometry with Multiple Spectrally-Adjacent Fluorescent Proteins and Fluorochromes and Visualization of In Vivo Cellular Movement，Koji Futamura. Cytometry Part A � 87A: 830�842, 2015

2.https://www.sony.com.cn/zh-cn/cms/newscenter/techonology/2019/FY2019-HQ-Technology-2.html

3.https://cytekbio.com/pages/northern-lights#tab-overview

4.Spectral Flow Cytometry—Quo Vadimus?   J. Paul Robinson，Cytometry Part A � 95A: 823–824, 2019