核酸是一切生物都含有的存在于细胞核的重要成分，是生命现象中不可缺少的生物大分子，也是生物遗传信息的重要载体，它控制着蛋白质的合成和有机体细胞的机能，在生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异等生命活动中占有极其重要的地位，随着生物分子学的广泛应用，核酸定量已经成为一种常规化的实验手段，其中最常用的测定方法是紫外分光光度法和荧光染料定量法。

分光光度法

分光光度法是基于物质的光吸收特性来测定浓度的。核酸包含脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，是一种核苷酸聚合物，其核苷酸单体由戊糖、磷酸基和含氮碱基组成。其中，戊糖和磷酸可通过反应形成具有光吸收特性的产物，对此建立的分光光度法有定糖法和定磷法；而碱基本身便具有光吸收特性，可直接采用紫外分光光度法进行定量。

1、定糖法

原理：核糖中的戊糖可在浓盐酸或者浓硫酸作用下脱水生成醛类化合物可与某些成色剂缩合成有色化合物，可用比色法或者分光光度法测定其溶液中的吸收值，在一定的浓度范围内，溶液的吸收值与核酸的含量成正比。

RNA浓度测定：RNA与浓盐酸共热时发生降解，产生的核糖又可转变为糠醛，在FeCl3或CuCl2催化下，糠醛与3，5-二羟基甲苯（苔黑酚）反应形成绿色复合物，生成的绿色化合物在670nm处有最大的吸收值。测定范围在20~250μg。

DNA浓度测定：脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性环境中变成戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，生成的蓝色的化合物在595nm处有最大吸收值。测定范围在20~250 μg。

特点：该方法特异性较差，凡戊糖皆可反应，其他糖类及其衍生物、醛类和蛋白质等会干扰实验结果，操作过程较为繁琐，如今已较少采用。

2、定磷法

核糖核酸(RNA)含磷量约为9.5%，脱氧核糖核酸(DNA)含磷量约为9.2%，采用定磷法可准确测出磷含量，进而折算出样品中核酸含量。

原理：在酸性条件下，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当还原剂存在时磷钼酸立即转变为蓝色的还原产物—钼蓝；在650~660nm波长处具有最大吸收值，在一定范围内，根据吸光值与磷含量的正比关系确定无机磷浓度，进而确定核酸浓度。测定范围在1-10μg。

特点：该方法测定的是样品中的总磷量，若样品中含有无机磷杂质，需通过对照组扣除无机磷含量，该方法灵敏度相对较高，但易受蛋白质和核苷酸影响。

3、紫外分光光度法

原理：组成核酸分子的碱基，由于含有芳香环结构，具有紫外吸收的特性。吸收值在波长250-270nm之间，最大吸收波长是260nm。一般1μg/ml RNA溶液在1cm光径比色皿中的光吸收峰值约为0.022，1μg/ml DNA溶液的光吸收值为0.020。因此测定未知浓度RNA或DNA溶液在260nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。其中ThermoFisher的NanoDrop是当前较为常用的分光光度计。

特点：以NanoDrop为例操作简便，迅速，只试用于测定浓度大于0.25ng/ul，无法区分出DNA、RNA、降解核酸、游离核苷酸及其它杂质。

荧光染料法

原理：专门配套的荧光检测技术，只有与DNA、RNA或蛋白质结合后才发出荧光的染料。这些荧光染料只有与特异性的靶分子结合时才能发出荧光信号，采用荧光染料检测特定目标分子的浓度，可以对DNA和RNA进行精准定量，其检测过程需使用酶标仪或荧光计。

特点：以Qubit为例荧光检测过程对环境因素较为敏感，易受温度、光度等干扰，同时需使用专用的耗材和试剂，价格昂贵。相比NanoDrop，灵敏度和特异性均提高，可检测到pg级别。

实时荧光定量PCR法

原理：通过在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，使得核酸扩增过程呈现出实时的荧光信号变化，且其扩增指数期对应的Ct值与起始模板浓度的对数存在线性反比关系，由此，结合已知浓度标准品建立的标准曲线，可对核酸进行定量。该方法是基于特异性的引物和探针来检测的，可用于确定靶核酸的拷贝数。

特点：①qPCR可用染料法或探针法，探针法还可使用多重检测。②特异性和灵敏度均较高，引物和探针的特异性确保只对靶核酸准确定量，不受非目标核酸和其他游离核苷酸的影响。③需要特定试剂和仪器，操作过程繁琐、检测时间较长，依靠标准品确定样品浓度，只有当标准品与待测样品具有相同扩增效率时，其定量浓度才准确可靠。

魏祎 | 文案