cAMP/CREB-regulated LINC00473 ma

image.png

【摘要】LINC00473与LKB1的功能失活相关，LINC的高表达表现出较差的预后；LKB1失活的细胞系中，LINC与细胞的生长密切相关。机制上，LINC00473是由LKB1失活和随后的环腺苷酸反应元件结合蛋白（CREB）/CREB调节的转录辅活化子（CRTC）激活诱导的。LINC00473是一个核lncRNA，并与cAMP信号通路的一个组成部分NONO相互作用，从而促进CRTC/CREB介导的转录。

【介绍】
肺癌发病率高，80%为NSCLC，传统治疗效果不好；对于特定基因驱使的肺腺癌，靶向治疗取得了非常好的效果，但是对于其它常见体细胞突变如LKB1效果不佳。散发性癌症中，尤其是NSCLC，LKB1突变频率仅次于TP53和KRAS，约20-30%。K鼠中，L失活诱导肿瘤转移。LKB1失活影响使得对代谢药物的反应敏感，但损害了化疗药物的反应性。由于缺乏可靠的确定LKB1突变状态的方法，相应的临床研究并未开展。
LINCRNA是一类长度超200bp的非编码RNA

【结果】
Result1

image.png

LKB1-K781：LKB1-K781突变体 kinase-dead K781 mutant
H-I :outlier LINC00473 expression？？？？

image.png

C：石蜡包埋组织的免疫组化，lnc473阳性和阴性的信号值，PPIB是管家基因
F-G：TCGA数据，N-正常样本，T-配对肿瘤样本，UT-非配对肿瘤样本

image.png

结果：LKB1抑制lnc473的表达；lnc启动子区域的CREB-B9和CREB-G9的缺失显著降低lnc473的表达。LKB1抑制lnc473pro区域的表达， 但是LKB1 K78l突变不抑制lnc473Pro区域的表达；敲降掉CRTC1，lnc473pro区域表达显著升高。
A：慢病毒转染方法过表达LKB1后lnc473的表达下降了--两个细胞系：H157和A549
B：慢病毒转染方法敲降LKB1后lnc473的表达增加--两个细胞系H3123和H322
C-D：敲降掉lnc473的启动子区域的CREB后，lnc的表达明显降低。
H：Chip实验？？？？

image.png

Ki-67：细胞增殖指标
敲降掉lnc473后，lnc的转录水平和细胞数量均下降，而坏死的细胞数量明显增多。接着对小鼠注射肿瘤细胞，形成肿瘤移植模型，结果发现敲降掉lnc后肿瘤体积和重量明显下降。Ki-67免疫组化提示敲降掉lnc后细胞增值能力明显下降。

image.png
U6是核内mark，胞质的mark是tRNA，分别对核内和胞质进行PCR试验，发现lnc主要表达在核内。
RNA-FISH image.png
RNA pull-down试验证明了lnc473与蛋白质的结合。pull-down拉下了的蛋白中存在NONO，证明lnc与NONO的结合。在NONO的免疫沉淀中，lnc显著富集对比与IgG的免疫沉淀中。敲降掉lnc后CRTC1表达明显降低，过表达lnc后CRTC1表达明显上调。lnc的缺失减弱了由一些常见的LKB1缺失引起靶基因的表达改变 image.png