这篇笔记是几个视频内容的综合，每个视频里我只选取了几张PPT。主讲人举例了一篇已经发表的文章来进行具体的流程分析。这篇文章里的外显子数据分析基本是一个比较标准的流程。样品是来自法洛四联症（TOF）的患者（TOF是一种常见的先天性心脏畸形）。对照组使用的是一组正常人样品。分析的目的是试着去寻找导致这种疾病的risk factors（genes or variants）。视频地址：这里
法洛四联症基本病理为室间隔缺损、肺动脉狭窄、主动脉骑跨和右心室肥厚。 法洛四联症在儿童发绀型心脏畸形中居首位。
下面这张图是文献的作者的分析流程，虽然使用的参考基因组版本比较老，GATK软件也不是最新版的，但是流程是比较经典的，还是很值得借鉴的：
需要注意的是：如果你使用和文献里不同的GATK版本，得到的结果可能和文献里有较大的差别！
因为外显子测序的原始数据绝大部分是不公开的，所以有时候我们很难拿到测序的原始数据进行完整的流程练习。这里对于上面的文献来说也一样，所以主讲人团队就构建了fake data，从而可以进行演示分析的流程。因为数据很大，所以GATK团队把这些模拟数据放在了google cloud里，方便大家使用。数据地址链接：这里
在这个google cloud里，有一个名字为“synthetic-exomes-mutated”和它下面的“synthetic-exomes”文件夹里，是所有模拟数据的bam文件和bai文件，以便于我们使用（注意：使用google cloud需要先注册一个google账号）：
分析的具体代码可以在这个网站找到：https://app.terra.bio/#workspaces/help-gatk/Reproducibility_Case_Study_Tetralogy_of_Fallot/workflows
这个网站打开后，前3个流程是不需要我们具体了解的，是这个团队构建模拟数据的流程（这个网站去年还有一个30天免费的试用，结果现在木有了。。。在视频里，你可以直接在网站里运行你的data，这样就不用你自己找服务器去运行了）：
我们需要关注的是从第4个流程开始，是由bam文件如何利用GATK来生成GVCF文件；第5步是根据上一步得到的GVCF文件进行joint calling。从而得到cohorts VCFs。最后一步是使用GEMINI来预测variants。
拿到bam文件后，就可以call variants了，那么第一步是要先鉴别哪些是active regions。主要是根据reference先“切段”，每一个window是一定长度，默认值是多少主讲人说她也忘了，但是大概是几百bp左右。然后记录在这个规定长度的window里，有多少个events。比如说有多少个mismatches，多少个Indels，又有多少个soft-clips（什么是soft clips，请参考文章：基因组比对文件（SAM/BAM）中 Soft Clip 与 Hard Clip的含义描述）。
得到active regions之后，需要针对这些区域做重比对，从而组装最有可能存在的单倍体。再把这些单倍体比对到参考基因组上。就可以得到潜在的variants位点了。
第三步，haplotypecaller会把每一条read和单倍体进行配对，然后打分，输出一个矩阵。
然后软件会计算每一个位点最可能的基因型（实际上主讲人还讲了好多关于数学模型的东西，有的PPT我没有放上来，听不懂，对这个过程原理感兴趣的同学可以自己去看一下视频，我找了一篇中文的原理介绍：GATK：HaplotypeCaller变异检测，还有一篇：你的GATK haplotypecaller是怎么工作的？）：
运行haplotypecaller，如果你想让软件生成VCF文件，使用basic mode，如果想生成GVCF文件，需要添加参数。这里需要输入的文件是bam文件：
上面的代码最后生成的是一个一个的GVCF文件，每一个样品有一个GVCF文件。之后需要把这些单独的GVCF文件整合到一起，就是下面的步骤：joint calling。对于不同版本的GATK，在joint calling这一步有些许差别：
体现到代码上也会有差别，所以需要注意：
在运行完joint calling后，运行GenotyeGVCF，就可以得到最后的数据了：
拿到了最终的variants，我们还需要对它们进行过滤。来排除假阳性：
主讲人这里推荐一般使用GQ<20来过滤variants。
我们还可以把这些variants进行注释，可以帮助我们发现哪些突变是新生突变，而不是通过孟德尔遗传规律从父母那里获得的：
你也可以用Mutect2来进行tumor-normal pair的分析：
在这个网站里：https://www.csc.fi/en/web/training/-/gatk2019，GATK团队还推荐了几篇关于GATK的综述，供大家学习。因为我目前的课题没有涉及到全基因组/全外显子测序，所以我并没有去下载视频里的模拟数据进行练习，只是看了视频，先了解一下call variants的大体流程（虽然目前我不用这个软件，但是我得知道它是干什么的，别人提起来不至于啥都听不懂）。还有个原因是学校的服务器分给我的储存空间只有100G，不够好几百个bam文件放在里面去分析了。有条件的同学、需要使用GATK分析自己数据的同学，还是要去阅读这些综述，可以有一些更深的了解。
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