一、研究背景

多发性骨髓瘤（MM）是一种常见的血液学恶性肿瘤，以单克隆浆细胞的肿瘤性增殖为特征。在过去的15年中，下一代测序（NGS）技术的出现为癌症遗传学的研究提供了强有力的工具。MM在各种癌症类型中表现出中等水平的肿瘤突变负荷（1.6个突变/Mb），这表明基因突变在MM的发生和发展中具有重要作用。

2014年以来，多项研究利用NGS技术探讨了MM的基因突变情况，作者的结论是一致的：即MM中复发性最高的突变基因是KRAS（突变率，20-23%）和NRAS（19-20%）。其他常见的突变基因包括DIS3、FAM46C、BRAF、TP53和TRAF3。2020年，Ordoñez等人使用多表观基因组学方法比较了恶性浆细胞与正常B细胞，发现肿瘤细胞中调控元素的广泛激活，导致参与NOTCH、NF-κB、mTOR和p53信号通路的成员过度表达，促进浆细胞的增殖。这些数据表明，表观遗传学变化在MM发病机制中发挥了重要作用。

二、材料与方法

1、数据来源

肿瘤标本：共有147名NDMM患者被纳入研究；收集了实验室检查数据，如血红蛋白（Hb）、血清肌酐、骨髓浆细胞比例、乳酸脱氢酶（LDH）和β2微球蛋白（β2-MG）；通过PETCT、全身CT或全身MRI检测髓外疾病（EMD）的存在；使用细胞质免疫球蛋白荧光原位杂交技术（cIg-FISH），高危细胞遗传学异常被定义为至少有以下一项：del（17p）、t（4；14）或t（14；16）；染色体区域1q21的数字畸变也是通过cIg-FISH检测的

2、分析流程

1）新一代测序

2）突变的分析

3）预测nomogram模型的推导和验证：预测nomogram是使用Cox的比例风险模型建立的

三、实验结果

01 - 突变负荷较重的患者预后较差

共检测到343个突变基因，错义突变是最常见的突变类型。每位患者的突变总数中位数为17.0（范围1.0-35.0）。为了充分了解突变负荷的临床价值，作者对临床特征和突变的数量进行了综合分析（图1a）。与IgG和IgA MM相比，IgD MM患者的突变数量明显增多。由于ISS I期组的患者数量较少，所以将ISS I期和II期的患者合并。ISS III期患者的突变负荷明显重于ISS I期和II期的患者。

以20为阈值，将患者分为高突变负荷组（n = 47）和低突变负荷组（n = 100）。低突变负荷组的患者的PFS明显长于高突变负荷组的患者（图1b）。以类似的方式，低突变负荷组的OS明显长于高突变负荷组（图1c）。这些结果表明，高突变负荷与MM患者的预后不佳有关。

图1 突变负荷的临床价值

02 - 基因突变的概况

在本研究中，突变频率最高的前15个基因是KRAS、NRAS、FAT1、FAT4、KMT2C、KMT2D，RNF213，FGFR3，EP300，ZFHX3，ATM，BRAF，BRCA2，NCOR2和TP53（图 2a）。变体等位基因频率（VAFs）见图2b。

为了更好地了解前15个基因的生物学功能，作者使用DAVID进行了基因本体论（GO）的富集分析（图2c）。在生物过程（BP）类别中，突变的基因在 "转录调节，DNA诱导"和 "RNA聚合酶II启动子转录的正向调节 "这两个术语中明显富集。相应地，这些基因在细胞成分（CC）类别的 "细胞核 "和分子功能（MF）类别的 "DNA结合"中明显富集。富集结果表明，参与基因转录调控的基因（KMT2D、ZFHX3、KMT2C、EP300、BRCA2和TP53）可能在MM发病机制中发挥重要作用。有趣的是，在富集的基因中，KMT2D、KMT2C和EP300属于染色质调控因子（CRs），与KMT2C/D COMPASS复合物（KCDCOMs）的形成有关。

图2 新诊断的多发性骨髓瘤患者最常见的基因突变

03 - 染色体异常和突变基因之间的相关性

MM中最常见的细胞遗传学异常包括1q21的拷贝数增加、del(17p)以及IgH易位t(4; 14)、t(11; 14)、t(14; 16) 和t(14; 20)。然而，只有t(4; 14)被包括在进一步的分析中，因为有t(11;14)、t(14;16)和t(14;20)的病人非常少。

EP300突变率的增加与1q21的拷贝数增加有关，3个1q21的拷贝被定义为1q21增益，4个或更多拷贝被定义为1q21扩增。随着1q21拷贝的增加，EP300的突变率也逐渐增加（图3a）。此外，基因突变与该基因所在的染色体异常之间有明显的相关性。del(17p)的患者有明显更多的TP53突变（图3b），FGFR3的突变率在t(4; 14)患者中明显增加（图3c）。

染色体异常和基因突变的预后价值是用Kaplan-Meier生存分析来评估的。在有del(17p)的患者中，PFS有减少的趋势，但这并没有达到统计学意义（图3d）。作者根据del(17p)和TP53突变将患者重新分组为四组：两组都没有del(17p)和TP53突变的患者（n = 114），del(17p)组包含del(17p)阳性的患者（n = 17），TP53突变组包含携带TP53突变的患者（n = 13），两组都包含同时携带del(17p)和TP53突变的患者（n = 8）。这四组的中位PFS分别为28.0、15.5、10.0和9.0个月。四组中的PFS有明显差异（图3e），这表明通过联合使用del(17p)和TP53突变可以更好地对患者进行分层。接下来以同样的方式对OS进行了分析。与没有del(17p)的患者相比，有del(17p)的患者的OS较短（图3f）。两组、del(17p)组、TP53突变组和两组的3年OS分别为77.1%、52.1%、36.4%和19.0%（图3g）。与PFS相似，联合使用del(17p)和TP53突变可以更好地预测OS。此外，结果显示TP53突变对患者预后的影响比del(17p)更明显。综合分析1q21增益和EP300突变、t(4; 14)和FGFR3突变对预测患者的预后没有显示出更好的鉴别能力。

图3 染色体异常与基因突变的相关性

04 - ARID基因家族的突变是预后不良的潜在指标

如前所述，KCDCOMs复合体可能在MM的发展中发挥重要作用。遗憾的是，生存分析发现有无KMT2C、KMT2D或EP300突变的患者在PFS或OS上没有差异。因此，把重点放在这个复合体的另一个组成部分，即ARID家族（图4a）。在研究人群中，46名患者有一个或多个ARID基因家族的突变，错义突变是最常见的突变类型（图4b）。

为了更好地了解ARID基因家族对MM预后的影响，作者比较了有和没有ARID基因家族突变的患者的PFS和OS。将患者分为两组：ARID突变组（n = 46）是指携带ARID家族突变的患者，非ARID突变组（n = 101）是指没有ARID家族突变的患者。与非ARID突变组相比，ARID突变组的PFS明显较短（图4d）。同样，ARID突变组的OS明显短于非ARID突变组（图4e）。

图4 ARID基因家族突变

为了进一步评估ARID家族突变的预后意义，将其与ISS和R-ISS分期系统相结合。属于ISS/R-ISS I期且没有ARID家族突变的患者仍分为I期；属于ISS/R-ISS III期且有ARID家族突变的患者分为III期；其他情况均分为II期。

根据ISS，23名患者为I期，47名患者为II期，77名患者为III期。PFS无法精确区分，尤其是II期和III期之间（图5a）。在ISS + ARID分期系统中，19名患者为I期，113名患者为II期，15名患者为III期。随着阶段的发展，PFS明显减少，这支持了ISS+ARID分期系统更高的预测能力（图5b）。这也是OS的情况。根据ISS分期，患者无法明确区分（图5c），而使用ISS+ARID分期，OS有明显差异（图5d）。

根据R-ISS，18名患者为I期，89名患者为II期，31名患者为III期。这三组之间的PFS没有明显差异。使用ISS + ARID分期系统时，15名患者为I期，114名患者为II期，9名患者为III期。ISS + ARID分期在区分PFS方面显示出更好的性能（图5e）。在OS方面也有类似的发现。根据R-ISS分期，患者无法明确区分（图5g），而使用ISS+ARID分期，OS有明显差异（图5h）。

图5 ISS+ARID和R-ISS+ARID分期系统

05 - 基于ARID突变的nomogram构建和验证

在去除缺失值后，得到136名具有完整临床数据的患者。候选变量被加入到PFS和OS的Cox比例风险回归模型中，包括年龄、性别、EMD、亚型、DS分期、ISS分期、R-ISS分期、LDH水平、高危细胞遗传学异常、贫血、肾功能不全、1q21拷贝数、突变负荷、ARID家族突变和TP53突变。最终的变量是根据逐步回归的系数和P值以及临床价值来选择的。

建立了一个包括TP53突变、突变负荷、ARID家族突变、EMD和1q21拷贝数的PFS的nomogram模型（图6a）。将每个变量的分数相加计算出总分，总分对应的预测风险就是PD的概率。ROC图显示该模型在预测1年和2年PFS方面表现良好，AUC为0.731和0.741。从该模型得到的Brier评分为0.157和0.203，证实了校准是可以接受的（图6b）。偏差残差检验没有发现异常值（图6c），Schoenfeld残差检验表明Cox模型符合比例危险性假设（图6d）。通过内部验证，该模型的AUC和Brier评分均令人满意（图6e）。

图6 疾病进展1年和2年概率的nomogram模型

同样，通过使用TP53突变、突变负荷、ARID家族突变和1q21拷贝数来建立OS的nomogram模型（图7a）。与总分相对应的预测风险是死亡的概率。该模型在预测1年、2年和3年的OS方面表现良好，AUC为0.769、0.769和0.746。从模型中得到的Brier评分为0.078、0.134和0.156，证实了校准是可以接受的（图7b）。通过偏差残差测试（图7c）和Schoenfeld残差测试（图7d）没有发现异常值。通过内部验证，AUC和Brier评分证实该模型有资格预测OS（图7e）。

图7 1年、2年和3年死亡概率的nomogram模型

四、结论

总之，作者的发现强调了CRs突变在NDMM患者中的重要性，影响KCDCOMs的突变可能促进MM的发展。高突变负荷和有ARID基因家族的突变是MM不良预后的新预测因素。基于1q21拷贝、ARID基因突变、髓外疾病、突变负荷和TP53突变的预后模型是值得称赞的OS和PFS的预后评估方法，为临床评估提供了参考。