肺部疾病目前在全球死亡原因中排名第三，因此全面了解决定肺功能的细胞和微环境特征对我们治疗或预防肺部疾病有着重要意义。肺除了气体交换的主要作用外，还具有重要的屏障功能。在以往的研究中已发现其他器官中存在粘膜相关淋巴组织(MALT)以协调适应性免疫，但目前在健康人肺中尚未报道此类继发性淋巴组织。不仅如此，目前绝大多数肺部细胞图谱都是在优先考虑肺实质组织的前提下建立的，很少有研究会针对气道结构和细胞组成而建立全面的细胞图谱。
2022年12月21日，英国剑桥大学威康桑格研究所的Kerstin B. Meyer教授团队在Nature Genetics杂志上发表了一篇题为 A spatially resolved atlas of the human lung characterizes a gland-associated immune niche 的研究论文。作者对已故器官供体的健康肺和气道进行了深层组织分析，利用单细胞、单核转录组测序、VDJ-seq及无偏空间转录组学方法来分析健康人类肺和气道组织微环境中的细胞类型和状态，并基于深度组织分析与空间基因组学的相结合，发现了宏观和微观解剖组织区室，包括上皮、血管、基质和神经束微环境中以前未注释的细胞类型。此外，该研究中还鉴定到了一种对呼吸系统健康有影响的“新腺体相关免疫生态位”，即肺腺体上皮细胞会募集B细胞和IgA浆细胞，并通过表达CCL28、APRIL和IL-6在局部维持这些细胞的存在与抗体分泌。
01 人类肺和气道的空间多组学图谱
作者首先将scRNA-seq、snRNA-seq、VDJ-seq和Visium 空间转录组（ST）应用于来自人体肺部和气道五个位置的深层组织样本，以捕获软骨、肌肉和粘膜下腺（SMG）等结构。在单细胞/单核转录组测序中，作者还通过采用多种组织解离及分选策略来广泛的获取全面的细胞类型数据，最终共得到193,108个高质量细胞和细胞核数据，注释为经典的细胞大类（包括上皮细胞、免疫细胞、红细胞、内皮细胞和基质细胞），并利用ST对来自5个位置的20个组织切片来评估不同组织微环境中细胞的空间分布。在空间的数据上，同样也得到了与空间结构所吻合的高质量数据，如被基底细胞包围的气道管腔中的纤毛上皮细胞，肺实质细胞中的肺泡1型(AT1)和2型(AT2)细胞等。为了进一步测试与实验批次、供体差异和样本处理策略所带来的数据差异，作者使用泊松线性混合模型来确定每个技术变量的贡献，发现不同的解离方案仅对特定细胞类型组有丰富的影响，而对基因表达的影响很小。又为了进一步强调该方法的综合性，作者基于转录特征定义了人肺中的软骨细胞(ACAN, CHAD, COL9A3, HAPLN1和CYTL1)，并将它们映射到ST气道软骨数据中进行重复，发现两维度下软骨细胞的表达和分布都得到了印证，并且大多数软骨细胞数据来自于单核测序。该软骨细胞数据表现和捕获策略表明了多重测序策略下带来的数据优越性，并表明了该多组学、多位置人类肺图谱的可靠性。
02 气道黏膜下腺中导管细胞的鉴定
在上皮细胞室中，作者鉴定了已知和罕见的细胞类型，并从中定义了人肺黏膜下腺导管细胞。作者通过ALDH1A3、MIA和RARRES1的smFISH染色，对人肺中SMG的定位进行了验证，还根据图像结果这些细胞与其他上皮细胞的区室所分开。有意思的是，SMG粘液细胞和浆液细胞在空间数据上的分布正好区分了SMG导管细胞的不同位置，这也为SMG粘液细胞鉴定一种新的细胞类型提供了证据。不仅如此，作者还在snRNA-seq和ST数据中鉴定了定位在腺体周围的肌上皮细胞（表达基底上皮细胞[TP63和KRT14])和肌细胞[ACTA2、TAGLN和CNN1]标志物）。
在空间上，为了进一步区分各类型上皮细胞的特征，作者通过非负矩阵分解(NMF)的无偏分析方法发现基底细胞和上基底细胞与顶端表面上皮细胞都具有独特表达模式，该结果也与它们在表面上皮底部的差异分布相印证。而且AT1细胞与毛细血管、肺泡巨噬细胞和成纤维细胞存在共定位，而与AT2细胞的分离分布。
总的来说，作者通过联合多组学数据，从单细胞/单核维度-空间维度的多重分析角度揭示了黏膜下腺上皮细胞的完整细胞组成及其在人肺黏膜下腺中的空间背景。
03 细胞间相互作用和黏膜下腺的免疫细胞生态位
为了进一步探索腺体相关免疫生态位（GAIN）的分子机制，作者对在SMG中存在共定位的B细胞、IgA浆细胞和T细胞进行了基因水平的分析。作者发现PIGR（可通过表面上皮介导聚合Ig）和CCL28（可通过CCR10募集IgA浆细胞）在SMG上皮细胞存在高表达。并且，作者通过smFISH和免疫组化实验在基因水平和蛋白水平对CCL28在SMG中的表达进行了验证，观察到CCL28的表达存在沿近端到远端轴的梯度变化，而且CCL28在SMG导管和气管浆液细胞中的表达是最为显著的。在细胞间相互作用分析中，结果显示SMG上皮细胞和B浆细胞之间的强互作CCL28-CCR10轴。另外，增殖诱导配体(APRIL)是B细胞存活、分化和类别转换的重要因子，可通过SMG导管/浆液细胞与B细胞上的受体TACI和BCMA相互作用表达。作者通过补充smFISH实验，发现APRIL在腺体中确实存在表达，而且观测在APRILhigh浆液腺中的特异性B细胞和IgA也存在共定位。更重要的是，该研究数据中的SMG导管/SMG浆液细胞还存在IL-6的表达（IL-6与APRIL联合诱导和支持长寿命浆细胞），提示着腺体相关免疫生态位在肺部免疫功能维持中重要性。
结论和意义
该研究采用多种组织处理及细胞分选策略和scRNA-seq、VDJ-seq、snRNA-seq与ST的多维度数据整合，鉴定了11种新的肺细胞类型，构建了深度且全面的人肺细胞图谱，并描绘了一个人肺腺体相关的免疫生态位特征，为了解和预防肺部疾病的发生提供了新的理论依据。
参考文献：
Madissoon E, Oliver AJ, Kleshchevnikov V, Wilbrey-Clark A, Polanski K, Richoz N, Ribeiro Orsi A, Mamanova L, Bolt L, Elmentaite R, Pett JP, Huang N, Xu C, He P, Dabrowska M, Pritchard S, Tuck L, Prigmore E, Perera S, Knights A, Oszlanczi A, Hunter A, Vieira SF, Patel M, Lindeboom RGH, Campos LS, Matsuo K, Nakayama T, Yoshida M, Worlock KB, Nikolić MZ, Georgakopoulos N, Mahbubani KT, Saeb-Parsy K, Bayraktar OA, Clatworthy MR, Stegle O, Kumasaka N, Teichmann SA, Meyer KB. A spatially resolved atlas of the human lung characterizes a gland-associated immune niche. Nat Genet. 2023 Jan;55(1):66-77. doi: 10.1038/s41588-022-01243-4. Epub 2022 Dec 21. PMID: 36543915; PMCID: PMC9839452.
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