1565 年 5 月 18 日，土耳其人带着一支由 193 艘船和 48,000 人组成的舰队出现在马耳他，并开始对该岛进行猛烈围攻。马耳他医院骑士团团长带领他的部下抵御围困，直到西班牙援军到来。
马耳他大围攻，也称马耳他之围发生于1565年，是年奥斯曼帝国入侵马耳他岛，受到“马耳他骑士团”的激烈抵抗。
医院骑士团成员、四到五千名马耳他平民和约两千名步兵共同取得了这场围城战的胜利。这是历史上最为血腥和激烈的围城战之一，亦是十六世纪欧洲最值得称道的事件之一。伏尔泰也说过：“没有什么比马耳他之围更有名了。”这场围城战是西方基督教联盟和奥斯曼帝国地中海霸权之争的高潮点。
虽然基督教世界敲响了胜利的钟声，点燃了欢庆的篝火，但在地中海中部，没人认为马耳他战役宣告了奥斯曼帝国野心的终结。在土耳其舰队返航之后，基督教各国的外交报告中仍然充满命悬一线的危机感。马耳他已经是一片废墟；它的防御工事化为瓦砾，居民负债累累、贫穷无助。幸存的骑士当中很少有人能够再战斗。毫无疑问，1565年的惨败伤害了苏莱曼的自尊，他在重建舰队，必然会再次征讨。“他已经下达旨意，”当年10月从伊斯坦布尔发出的一份报告称，“到第二年3月中旬，必须有5万名桨手和5万名士兵就位。”欧洲仍然处于恐慌中，毫无安全感可言。他们几乎没有时间集结军队、收集金钱和重新武装马耳他岛。人们在希伯拉斯山上开始疯狂地修建一座新城堡，并将其命名为瓦莱塔，以纪念骑士团的大团长。人们紧张地注视着东方。
但是，除了对意大利发动了一次不痛不痒的袭击外，土耳其人放弃了大海。奥斯曼帝国的征服转向了匈牙利。第二年，苏莱曼御驾亲征。这是他的第十三次出征，也是他近十二年来第一次出征。苏丹已经七十二岁高龄，身体状况不佳，不能骑马，只能乘坐笨重的马车。他率领的是他一生中征集的最庞大军队。这将是施展帝国威严的时刻。在马耳他战役后，苏莱曼希望重新确立自己的地位，以显示自己的的力量仍然能够撼动世界。
马耳他大围攻之后，随着奥斯曼帝国势力的衰弱以及俄罗斯帝国取代奥斯曼帝国成为西欧东部的重大威胁，骑士团对抗奥斯曼帝国的使命的重要性也日益下降，骑士团在欧洲列国中的声誉和威望也受到了影响。此后，骑士团一直作为一个不重要的实体，在地中海地区存在的主要使命是为欧洲各国训练海军，以及资助优秀的艺术家和作家。在马耳他大围攻之后，马耳他骑士团作为欧洲之盾的使命就逐步地结束了。
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