关键词

LFIA，多孔铂核-壳纳米颗粒，纳米酶，生物正交化学，POC，HIV检测

文献信息

“Platinum Nanocatalyst Amplification: Redefining the Gold Standard for Lateral Flow Immunoassays with Ultrabroad Dynamic Range”

DOI: 10.1021/acsnano.7b06229

ACS Nano 2018, 12, 279−288

伦敦帝国理工学院

摘要

LFIAs是使用最广泛的POC检测方法之一，然而，它们在早期疾病中的应用由于对检测样本量的灵敏度不足和POC检测时间短，诊断往往受到限制。为解决这个问题，我们开发了一种血清稳定，铂氧化纳米颗粒催化剂标记的LFIA，其检测p24的灵敏度底物超越了目前的商业和发表文章中的灵敏。最早和最保守的HIV生物标记物。我们报道了核-壳纳米催化剂(PtNCs)的合成与表征，当暴露于复杂的人血清样本时表现出高催化活性。我们探索了抗体功能化PtNCs与对p24具有高亲和力和特异性，以及正交修饰纳米体的应用，并建立了在LFIA中高效扩增和性能所需的关键更大的纳米颗粒尺寸体系。利用PtNCs的催化扩增使肉眼检测p24在低摩尔范围内(约0.8 pg/mL)。加入血清，并在20分钟内检测临床人类血浆样本中的急性期HIV。这提供了一种多功能的基于吸收的快速LFIA，其敏感性能够显著缩短HIV急性期检测窗口。这种诊断可以很容易地用于其他生物分子的检测，作为传染病和非传染性疾病的超灵敏筛查工具，并且可以在POC环境中用于早期疾病检测。

摘要图.

研究背景

传染病是对人类健康的最大威胁之一。最近寨卡病毒和埃博拉病毒的流行以及持续的艾滋病毒大流行继续突出了对负担得起、敏感、简单并能够在具有挑战性的情况下快速检测病原体的诊断工具的需求。这些需求导致了LFIAs诊断方法的使用。虽然满足了许多这些标准，但它们的灵敏度通常低于其他蛋白和核酸检测方法。开发POC诊断的持续障碍是必须在灵敏度、简单性、速度和成本之间做出妥协。一个巨大的挑战是在资源有限的环境中开发诊断工具，而这些环境要求所有设备都具有出色的性能。

敏感的诊断平台通常包括信号或靶标放大机制，例如用于检测核酸的聚合酶链反应(PCR)和等温核酸扩增，或用于检测蛋白质靶标的酶催化信号放大和免疫PCR然而，这些技术对资源的要求相对较高，需要专业的技术知识来运行和解释(例如，净化步骤)，并且在资源有限的环境中，不可靠的电源供应和维护挑战限制了它们的使用，因此使用设备往往不兼容。由于混合贵金属催化纳米颗粒具有较高的催化效率和在高温和极端pH等恶劣环境下的稳定性，已成为比色免疫分析中有前景的信号放大材料。我们在这里表明，通过研究无机纳米颗粒催化剂的尺寸和孔隙率，将其纳入横向流动测试格式，提供了一种显著提高简单易读、基于吸光度的LFIAs灵敏度的途径。这导致了一个简单的和具有成本效益的纸质诊断测试，其性能水平远远领先于目前的LFIA标准。

在这里，我们将过氧化物酶模拟多孔铂核壳纳米催化剂(PtNCs)集成到敏感的LFIA中，检测HIV病毒衣壳蛋白p24。急性艾滋病毒感染在诊断中构成了一个独特的挑战，因为它包含了从最初感染到完全血清转化的时期(患者对艾滋病毒蛋白质产生抗体的时期)。在此窗口期，缺乏可检测的循环生物标志物，抗体在感染后约28天出现。艾滋病毒p24是感染后最早的蛋白质生物标志物，能够在早期检测到p24的测试将在关键目标环境中具有变动性，例如诊断已知母亲为艾滋病毒阳性的婴儿，在这种情况下抗体测试是不可靠的，并且还可以确保抗逆转录病毒疗法在可能最有益的情况下进行早期干预。然而，在急性感染期间，p24的临床相关范围远低于领先的现场就绪比色LFIA测试的可检测限度(约10-15 pg这受到彩色标签的吸光度和抗体识别成分的亲和力的限制。

通过设计和优化纳米催化剂放大平台、高亲和力和正交设计的结合组件以及横向流动架构，我们展示了以前在LFIA格式中无法实现的高水平的灵敏度和广泛的动态范围。此处开发的催化放大工艺允许在加标中进行测试血清，使其灵敏度超过领先的p24商业快速检测(例如，Alere确定HIV-1/2 Ag/ Ab组合和Alere HIV组合)，最高可达20倍。在这里，我们发现在加标血清(约32.5 fM)中检测到低飞摩尔浓度的p24，并且在临床血浆样本中肉眼检测到急性期HIV在20分钟内。

结果与讨论

LFIA用于快速确定目标分析物是否存在于复杂样品(血液、血浆、血清等)中，使用简单的比色读数。当检测标签(通常是颜色强烈的纳米颗粒)被样品水化时，LFIA的核心过程开始，通过毛细管作用沿着纸膜拉伸，并通过目标分析物结合到条带的一个称为测试线的区域。为了实现这一点，纳米颗粒和测试线都必须用亲和配体(通常是抗体)装饰，能够结合目标分析物的离散区域。为了在LFIA格式中实现高水平的灵敏度，组件必须表现出对固相的快速结合反应动力学，以确保颗粒标签可以在样品流过的短时间窗口内结合到测试线上。使用高亲和力的结合系统，如生物素链霉亲和素。在10-15 M)的测试线中，结合捕获步骤对于向目标移动是必不可少的，在这个目标中，所有靶抗原都在测试线上用纳米颗粒标记这种结构的优势意味着抗体结合复合物在溶液中形成，生物素-链霉亲和素相互作用是在测试线上固定复合物的快速结合事件。这就避免了传统抗体捕获通常较差的性能，因为生物素-链霉亲和素结合亲和力比传统抗体-抗原相互作用高4个数量级。

我们的PtNC放大LFIA利用简单、低成本平台，通过纳米颗粒本身的催化活性，在测试线上的染料局部沉积来增加信号强度，具有很强的放大机制。图l a中的原理图突出了PtNC放大LFIA的基本组件和配置。在检测过程中，将血浆(或血清)样本引入含有冻干抗体修饰的PtNCs和灵活的、正交生物素化的骆驼抗体片段(纳米体-生物素)的容器中，这些片段能够与p24衣壳蛋白的独立表位区域结合。接下来，一个由硝化纤维反应膜和吸收垫组成的横向流动条带，被用来通过毛细管作用将溶液沿着条带拉向链霉亲和素轴承测试线。在存在的地方，样品中的p24可以夹在抗体- PtNC偶联物和生物素化抗体片段之间，形成生物素化复合物，在链霉菌亲和素包被测试线上捕获。在高目标浓度(100-10,000 pg/mL p24)下，由于测试线上结合的颗粒的固有吸收，肉眼可见一条清晰的黑线，表明测试结果为阳性。通过利用PtNCs催化放大作用于不成比例的H2O2，使显色底物氧化，可见较低浓度的目标。将血浆样品通过后，再经过追赶缓冲液，将测试线暴露于双氧水和显色底物的混合物中。在测试线上捕获的任何PtNC都将氧化底物，产生不溶性的彩色产品。这个放大步骤增加了灵敏度窗口，降低了2个数量级的检测极限。由于在测试线上沉积了明确的彩色产品，检测结果可以很容易地用眼睛读取或用手机摄像头捕捉以进行分析，具有半定量结果读取的潜力，具有放大前和放大后的信号机制。

图1 b概述了用于制备具有定向生物素的抗体片段的位点选择性修饰策略。具体来说，将热稳健和高亲和力的纳米体组件集成到纳米催化剂标记的LFIA中。纳米体是包含一个完整抗原结合位点的单结构域抗体片段，但只有传统抗体的十分之一大小。除了它们的小尺寸和稳定的构象外，它们可以在具有位点选择突变的细菌中有效地大规模生产，从而实现双正交化学。因为纳米体修饰和纯化的便利性和控制，我们选择生物素化一个p24结合的纳米体验证针对广泛的艾滋病毒亚型，以促进PtNC - 分析物复合物结合到链霉亲和素测试线。

一种含有溶剂可接近的抗p24纳米体表达末端半胱氨酸残基以实现位点选择性生物素化。半胱氨酸残基的位置，在一个灵活的6聚合物HIS-tag连接物的末端，被选择以最大限度地扩大后续修饰与纳米体的对位层之间的距离(结构模型见图1b)，从而最大限度地减少破坏通过与生物素功能化吡啶二酮(PD)反应，实现了半胱氨酸残基的位点选择性生物素化，这是使用PD化学修饰纳米体的第一个例子。利用LC-MS对纳米体修饰后的分析证实，只添加了一个生物素分子，证明没有不良的脱靶结合。吡啶嗪二酮在抗体修饰方面有良好的记录，与其他半胱氨酸选择性试剂(如马来酰亚胺和卤代乙醯胺)相比具有许多优势，这些试剂已被证明可与赖氨酸残基反应，而且通常表现出较差的长期稳定性。通过这个方法，我们特别设计了纳米体，使生物素远离p24结合区，从而在我们的分析中实现定向呈现。

我们检查了修饰和未修饰的纳米体与p24的结合动力学，发现位点选择性修饰对解离常数没有显著影响，证实该修饰不会干扰抗原结合区域。位点选择性生物素化的纳米体绕过了富含赖氨酸残基的纳米体paratope的非特异性修饰(图1b中橙色部分)。其中标准的碳二亚胺交联剂修饰策略将有干扰结合位点从而破坏活性的风险。半胱氨酸纳米体的位点选择性生物素化保留了表位识别，并确保有效利用样本中可用的p24。我们选择了一种单克隆抗体(抗hiv -1/2, Capricorn产品)，它是与纳米bodybiotin的p24结合对，可以物理吸附到纳米催化剂上这种正交修饰的纳米体和物理吸附的整个IgG抗体的耦合使PtNC扩增检测的快速工程成为可能。纳米体突变、表达和正交修饰可以在几天内很容易地实现，适当的PtNC催化剂的制备可以同时进行标准的商业使用链霉亲和素免疫层析膜。

图1c突出显示了PtNC放大LFIA的广泛动态范围，其跨度超过4个数量级。这种双重灵敏度是由PtNC固有的着色(用于检测100-10000 pg/mL的分析物)和它们催化生成着色产品来装饰测试线的能力实现的，从而获得从100到小于1 pg/mL分析物的第二种状态。这比标准比色ELISA或第四代LFIAs的动态范围宽了约2个数量级，后者分别局限于催化后或颗粒标签的着色。

图1.

为制备具有高催化活性和有效抗体修饰的PtNCs，它们的合成需要仔细优化。在制备早期，颗粒被聚乙烯吡咯烷酮(PVP)覆盖，以确保胶体稳定性(补充图2)，并减少在LFIA过程中暴露于复杂介质时发生的污垢程度。在粒子合成过程中使用的PVP分子量在决定PtNCs(在抗体修饰之前)的催化活性方面发挥了重要作用，如图2 a所示，它们氧化四甲基联苯胺(TMB)的能力突出了这一点，10 kDa PVP包裹的粒子表现最佳。抗体覆盖的PtNCs的一个关键性能要求是，它们可以在暴露于复杂环境(患者血清含有约7%的蛋白质。)后保持其催化活性。事实上，当以这种方式用10 kDa PVP和抗体修饰制备PtNCs时，发现在24小时内保留了大量的初始颗粒活性(约75%)(图2 b)，远远超过血清学测量中预期的暴露时间。尽管蛋白质对PtNCs的吸附会降低颗粒的催化活性，但它的好处是使其与抗体的修饰变得简单，在正确的化学计量学和适当的pH值下将PtNCs与抗体混合，产生具有有效偶联抗体的PtNCs(补充图 3)。

图2 c和补充图4 TEM图像显示，使用种子合成可以精确控制PtNC的尺寸和单分散性。PtNCs可以用多孔的多晶铂壳生产。我们观察到PtNC催化活性的显著贡献来自颗粒的内部催化表面积，这通过评估15和40 nm核的金芯尺寸的作用(补充图 5)显示。该额外的表面积可通过铂壳内的纳米级孔隙(TEM图像分析约为12 nm)获得。这可能导致气孔无法进入大分子(如抗体和血清蛋白)，但可以进入较小分子(如H2O2)，使其非常适合暴露于富含蛋白质的血清环境后用于催化扩增过程。

选择较小的15纳米金纳米颗粒作为种子，通过调节用于后续过度生长的金种子的浓度，制备出直径约为280纳米的PtNCs(图2 d)。大于ca的粒子。通过在合成的约120 nm PtNCs上逐层沉积铂得到150 nm。不同大小的PtNCs的高角度环形暗场STEM (HAADF-STEM)图像与相应的能量色散。EDS证实了核壳结构，Au核和Pt被限制在外部多孔壳中(补充图 6,7)。由于铂过度生长的成核点浓度明确，动态光散射测量的多分散性保持在较低水平(0.01 < PDI < 0.1)，确保了合成的可重复性(补充图 8)。这种种子合成的精细尺寸控制允许控制后续的抗体修饰。

PtNCs提供了一个理想的平台来评估催化颗粒尺寸对LFIA灵敏度的作用，因为它们的核壳结构和高孔隙率以及由此产生的与颗粒尺寸无关的大催化表面积。在这种种子合成过程中产生的颗粒的纳米尺度粗糙度和形貌随着尺寸的增加而保持不变(补充图 4,6)。当用于LFIA时，纳米催化剂的尺寸对获得的PtNC尺寸达到280 nm时的测试线信号强度有明显影响。更大的粒子具有更大的催化反应表面积，预计将在LFIA格式中产生更高的信号，事实上，在一定程度上，这是实验观察到的。我们合成了大小在50到280 nm之间的PtNC，并用最佳的抗体表面密度进行修饰(补充图 3)。保持PtNC浓度不变(150 pM)，使用不同大小的PtNC作为LFIA格式的催化标签，用于添加100 pg/mL p24和生物素化纳米体的血清样本。信号强度的变化粒径函数如图2e所示。更大的颗粒会导致信号强度的增加，这反映了催化反应表面积的增加。然而，我们观察到这种影响在接近150 nm区域的阈值时最为突出，超过该阈值性能就会降低。对于较大的颗粒，信号强度的降低可能是由于扩散率的降低和相应的内部孔隙率的降低(以及催化活性的降低)，这是由逐层合成引起的(补充图7)。PtNCs在120-200 nm直径范围内表现出最佳性能，因此由于它们易于一步合成，低非特异性结合，以及最大限度地减少使用过量铂的需要，120 nm PtNCs被用于进一步的实验。

图2.

研究了测试试剂的可重复性和稳定性。

图3 a显示了五个独立产生的测试线强度合成了约120 nm的PtNCs批次，用于检测50 pg-mL- p24加标血清(补充图8)。红线表示各批次的平均测试线强度。5个独立合成批次与抗体修饰批次之间的变异系数为2.4%，表明PtNC扩增的LFIA通过合成抗体是可重复的偶联，化验运行步骤。这表明我们的纳米催化剂平台对可靠的临床样本检测有很大的希望。

稳定性是POC设备的一个关键方面，其中检测标签和抗体成分的性能必须独立于测试可能暴露的存储条件。许多测定方法需要受控的温度储存条件，这给供应链增加了成本，并可能阻止在高温地区使用，从而限制了该检测方法在发展中国家的使用。酶和抗体试剂通常是最容易长期储存的成分，尽管有适当的干燥条件和基质，长期干燥储存是可能的加速老化研究，如图3 b所示，是在冻干试剂上进行的-比较过氧化物酶模拟PtNC标签与其生物对应物HRP的稳定性，辣根过氧化物酶是免疫测定中用于催化扩增的最常用酶。

在老化实验中，纳米体-生物素和抗体偶联HRP或PtNC在含有蔗糖、牛血清白蛋白、PVP和吐温-20的缓冲混合物中冻干。在44℃或室温下冷冻干燥老化6周后，向干燥样品中加入p24加标等离子体，沿条带向上流动，催化扩增后测定测试线强度。PtNC扩增的LFIA在室温老化6周后，测试线强度没有明显变化，在44℃下孵育6周(相当于6个月室温老化)时，测试线强度变化很小。在44°C下孵卵3天后，观察到信号强度最初下降约25%，之后在42天的时间内没有额外的信号丢失。相比之下，当在LFIA中运行时，抗HIV抗体功能化的HRP标签在室温干燥存储2周后失去了90%的信号强度(这些样品不耐受高温老化条件)。这些组件的弹性对于确定系统是否适合POC使用至关重要，特别是在资源有限、冷链运输无法保证的情况下。特别是，这突出了使用坚固的无机催化纳米颗粒取代传统酶的好处，其中使用多孔PtNCs获得的催化扩增对快速老化具有高度的弹性。常规抗体可以很容易地物理吸附在金属纳米颗粒上，并在冻干时显示出显著的热稳定性。我们还观察到，在我们扩增的LFIA中，生物识别成分具有良好的长期稳定性，其中我们使用了传统抗体和生物素化纳米体的组合。然而，我们注意到纳米体表现出比传统免疫球蛋白更大的热稳定性(补充图 9)，我们看到了在该系统中搭配两个纳米体组件以进一步提高在最不利条件下使用的热稳定性的巨大潜力。

图3.

纳米催化剂标记的LFIA(采用约120 nm PtNC标记)在催化放大前后的灵敏度如图4 a所示，并附有催化放大前后加标血清中p24的信号强度和浓度图。测试线信号强度由手机摄像头捕获，这是一种现成的图像采集工具。与酶标记免疫分析需要催化才能显示不同，PtNC标记的LFIA实现了两个灵敏度窗口，催化前和催化后，利用了颗粒的吸光度和它们的过氧化物酶模拟活性(补充图10)。这使该检测具有双量程诊断机制，可通过使用基于移动电话的检测和图像分析进行量化。我们的实验显示了超过4的线性动态范围通过扩增前和扩增后的测量，从10000到<1 pg/mL蛋白靶(图4b)的数量级。如果在显色剂放大之前和之后拍摄图像，这可以使测试的潜在定量范围更广。PtNC放大的LFIA可以在20分钟内检测到p24在加药血清中降到0.8 pg/mL(约32.5 fM)，这在感染急性期的临床相关范围内，当个体感染最严重时，也是早期抗逆转录病毒治疗干预最有益的时候。

我们使用ZeptoMetrix公司(panel Donor No. 75062)收集的HIV血清转换面板，评估了PtNC LFIA在临床人类血浆样本中的性能。来自同一供体的纵向临床样本横跨一个月的血液采集期，包括血清转换进行评估。在盲法实验中，PtNC扩增的LFIA可以成功检测到ZeptoMetrix面板样本7到14中感染血浆中的阳性抗原水平，对应于急性期感染期间血液中抗原水平的增加，随后形成免疫复合物(图4c)。样本13和14对应低水平p24: 10.8 pg/mL ~ 211000 copies/mL HIV RNA和4.6 pg/mL ~ 46300 copies/mL(由ZeptoMetrix HIV p24抗原ELISA和Roche Cobas Amplicor HIV Monitor验证)。第四代HIV LFIA检测包含抗体检测线，以确保该测试可以检测出整个血清转换体系的HIV感染。我们设想用PtNC扩增的LFIA进行类似的方法，它仍然受益于免疫反应监测的动态范围的增加，而且在感染的早期阶段对p24具有异常的敏感性。

图4.

研究结论

我们报道了迄今为止最简单、最敏感的基于吸收的LFIA用于蛋白质检测，证明了它在临床显著范围内用于检测加标血清和血浆中的p24，以及在一系列临床样本中检测急性期HIV感染。我们通过将多孔催化无机纳米颗粒和热鲁棒抗体片段与易于修改的官能团配对，在简单的纸基平台上实现了灵敏度，以定向呈现固相识别元件。利用催化剂的多孔性，我们建立了催化纳米颗粒作为LFIA放大标签的最佳尺寸制度。我们通过精心定制PVP涂层和抗体偶联来平衡贵金属PtNCs对过氧化物歧化的高催化活性与生物分子吸附和阻断反应表面的同时倾向。我们展示了在LFIA中纳米体和纳米催化剂组件的效用，朝着简单，强大和高度放大的系统前进。结果是一个PtNC放大的LFIA，易于使用，可通过肉眼或手机摄像头读取比色输出。这种具有广泛双动态范围的快速检测的应用远远超出了艾滋病毒诊断。这个敏感的平台可以很容易地适应在疾病进展的多个阶段检测其他生物标志物和监测治疗效果。我们的多功能和模块化平台将高效无机催化标签整合到现有的LFIA技术中，增强了其在POC诊断中检测任何蛋白质目标的潜力。