Genomic analysis of Vascular Invasion in Hepatocellular Carcinoma (HCC) Reveals Molecular Drivers and Predictive Biomarkers-- Hepatology --14.679

思路

从肝癌伴血管浸润的转录组血分析、蛋白组学分析→找到差异mRNA、差异microRNA、差异protein的一个共同上游调控因子--MYC→构建MYC—HCC小鼠模型→分析人HCC与鼠HCC差异表达蛋白的交集→得到一个在人和鼠中较对照组都显著差异高表达的纤维连接蛋白→FN分析
小鼠FN分析证明FN高表达
证明FN1与MYC之间的调控关系（EPD数据库），FN1与MYC表达关系的泛癌分析→FN1在肝癌中的功能探究
人FN分析证明FN高表达（独立数据，公共数据-（HCPA））→FN与血管浸润、肿瘤分期分析→FN生存分析→FN作为晚期肝癌生物标志物分析（前瞻性试点病例对照研究（T：N==35：10））→

一、摘要

①利用多平台癌症基因组图谱（TCGA）数据（n=373）评估了血管侵袭性肿瘤的基因组、转录组和蛋白质组学特征。
②功能通路分析显示MYC癌基因是血管侵袭过程中mRNA、miRNA和蛋白质组学变化的共同上游调节因子
③我们对侵袭性人类HCC和MYC驱动的小鼠HCC进行了比较蛋白质组学分析，并确定纤维连接蛋白是侵袭性HCC的蛋白质组学生物标记物，在两个物种中保守。
④在机制上，我们发现FN1促进了HCC癌细胞的迁移和侵袭表型。
⑤我们使用一组独立的人肝癌组织微阵列（n=153；p<0.001）证实了纤维连接蛋白在人肝癌组织中的过度表达
⑥最后，我们发现HCC患者血浆纤维连接蛋白水平（n=35，平均值=307.7μg/ml，SEM=35.9）显著高于肝硬化患者
⑦我们发现MYC上调纤维连接蛋白的表达，从而促进HCC的侵袭性
⑧我们发现纤维连接蛋白是一种很有前途的非侵袭性蛋白质组学生物标志物

二、介绍

①肝癌死亡率高，预后差；手术和移植提供了治愈肝癌的可能，但是复发率高。
②血管侵袭在肝癌中占（25%-50%），现有标志不能确定肿瘤的侵袭性，术前影像学检查也不总能获得血管侵袭相关信息。
③先前研究已经评估了血管侵袭的基因特征及临床危险因素，但是预测性生物标记并不是目前临床实践的一部分；尽管HCC进展的分子机制已经被广泛研究，与血管侵袭相关的特异性驱动基因和分子途径仍不清楚。
④我们进行了这项研究，以全面分析肝癌血管侵袭的基因组和蛋白质景观

三、结果

1、血管侵犯是肝癌复发的预测因素

①血管侵犯（VI）出现在34.9%的肿瘤中（n=111），大血管侵犯出现在5.8%（n=17），微血管侵犯出现在29.1%（n=94）（图1a-1b）。
②血管侵犯的患病率随着肿瘤分期的进展而增高（I期14%，II期64%，III期53%）（p=0.03）（图1c），肿瘤分级的进展（低分级15%，中/高分级46%）（p=0.03），血清甲胎蛋白的升高（p=0.02）（图1c）。
③微血管侵犯（64%）或大血管侵犯（65%）的肿瘤复发率高于无血管侵犯（45%）（p<0.001，图1d）。
④与无血管侵犯者相比，存在大血管侵犯者的总生存率更差（3年44%对73%，p=0.001）（图1e）。微血管或大血管侵犯的存在与无血管侵犯的患者相比，无复发生存率显著降低（24%对33%对47%）（p=0.001）（图1e）。

因此，我们证明肝癌血管浸润的存在与肿瘤的侵袭性和不良的临床预后密切相关。

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⑤我们首先比较了有无血管侵犯的肿瘤的突变情况（图1f）
有无血管侵犯之间差异的突变仅有TP53和HIST1H1C。
HIST1H1C是染色质结构的调节因子
此外，我们没有发现有或没有血管侵犯的肿瘤之间的主要体细胞拷贝数变化有任何显著差异（图1f）（补充表1）。因此，我们的数据并没有揭示肿瘤与血管侵袭的基因型-表型之间的明确相关性，这促使我们进一步研究转录组学和蛋白质组学。

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2、肝细胞癌伴血管浸润的转录景观

①HCC的转录谱分析：我们鉴定出102个基因在有血管浸润的肿瘤中差异表达，其中92个基因过度表达，10个基因表达不足（图2a）（p<0.001，倍数变化≥2，FDR<0.1）（补充表2）
包括CDC20、XPOT、SIRT7，已经被报道过与肝癌发病机制相关。
其他基因如GTF2F2、ENGASE和RCCD1以前与HCC无关，但与其他癌症有关。
②通过比较血管浸润相关基因特征与多个已发表的肝癌预后基因特征，我们发现与肝癌预后不良相关的基因类别丰富，如Hoshida亚类S1（18）、Boyault G3亚类（19）和Woo肝癌复发特征（20）（图2b）。
③接下来，我们进行了上游调控通路分析（upstream regulator pathway analysi），以确定全球转录变化的遗传驱动因素。我们确定MYC、CREBZF、HOXD13、ATF4和ZBTB17是血管侵袭相关转录组最重要的上游调节因子（图2c-2d）。
我们进一步证实MYC是该表型的重要转录调节因子，证明血管侵袭相关的基因特征与先前报道的几个MYC基因特征显著重叠（图2c）

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④我们接下来鉴定了70个微RNA，它们在有血管浸润的肿瘤中差异表达，其中23个高表达，47个低表达（p<0.001，倍数变化≥2，FDR<0.1）（图2e，补充表2）。
⑤图2f显示了前10位的microRNA及其靶基因。这些microRNA中的一些如mir-122、mir-21和mir-100以前与HCC的发病机制有关，但并未特异性地促进血管侵袭（图2f）。没有看出来结论：（并未特异性地促进血管侵袭）是如何来的
⑥上调的microRNA的靶基因如PTEN、CDKN1B和CDKN1A是已知的肿瘤抑制因子，而被抑制的microRNA的靶基因如TGFA、VCAM1和ACC1则具有已知的肿瘤促进作用。因此，这些数据证明了microRNAs如何可能使肿瘤转变为更具侵袭性的表型。
⑦我们进行了上游调节因子分析，确定TP53、MYC、CDKN2A、NPM1和YBX1是差异表达的血管侵袭相关microRNA的五大转录调节因子（图2f）。因此，我们对具有血管浸润的肿瘤的转录谱的分析揭示了与侵袭性表型相关的基因和途径的丰富性，并确定MYC癌基因是HCC血管浸润的共同驱动因素。

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3、血管侵犯的肝癌中蛋白组学改变的功能评估

①我们比较了219种蛋白在有和无血管侵袭的肿瘤中的表达，并确定了87种差异表达的蛋白（图3a）（n=130，p<0.001；FDR<0.1；补充表3）。有血管浸润的肿瘤中前10位差异表达蛋白参与多种细胞功能，包括细胞粘附性、凋亡和代谢（图3b）。

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②蛋白质组学变化的功能途径分析显示，在有血管侵袭的肿瘤中，细胞活力（p=6.4x10-39）、细胞迁移（p=4.1x10-31）、增殖（p=1.5x10-49）和血管生成（p=3.5x10-14）等生物过程显著上调，而涉及凋亡的途径（3.1x10-54）衰老（7.7x10-15）显著下调（图3c-3d）。
③我们评估了观察到的蛋白质组学变化的上游转录调节因子。前5位调节因子分别是TP53（p=1.4x10-37）、MYC（p=8.7x10-24）、JUN（p=5.3x10-23）、E2F1（4.3x10-22）和FOXM1（p=1.7x10-19）（图3e）。同时，肿瘤抑制调节通路如RB1通路和VHL通路在有血管侵犯的肿瘤中显著下调（补充图1）。因此，对与肝癌血管浸润相关的整体蛋白质组学变化的功能分析清楚地描述了侵袭性肿瘤表型的特征

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4、跨物种比较蛋白质组学分析鉴定纤维连接蛋白为侵袭性肝癌的保守生物标志物

①MYC癌基因是HCC血管侵袭相关mRNA、miRNA和蛋白质组变化的一致上游调节因子（图3f）。这促使我们使用MYC驱动的HCC小鼠原位转基因模型（LAP-tTA/tet-O-MYC）进一步探索HCC中的血管侵袭（图4a）。
②我们发现血管侵犯是小鼠MYC-HCC的一个非常普遍的特征（75%，n=15/20肿瘤）（图4b）。
③我们使用液相色谱-质谱（LC-MS）评估了与MYC-HCC相关的整体蛋白质组学变化。与对照组小鼠肝脏（n=3）相比，在HCC肿瘤组织（n=3）中，共有392种蛋白质过度表达，360种蛋白质表达不足（P<0.05；FDR<0.05，倍数变化±2.0）（图4c）。
④我们证实了AFP、β-catenin、vimentin等已知在人类HCC中升高的蛋白在MYC-HCC中确实更高，而在人类HCC中被抑制的蛋白如氨甲酰磷酸合成酶1、酸性磷酸酶1和醛缩酶B在（ carbamoyl-phosphate synthetase 1, acid phosphatase 1 and aldolase B）MYC-HCC中更低（图4d）
⑤蛋白质组变化的上游调节因子被证实是MYC（p=8.2 X 10-79），但人类肝癌的其他遗传驱动因子如Trp53（4.1 X 10-53）和β-连环蛋白（4.2 X 10-23）也被发现是MYC-HCC蛋白质组变化的重要上游调节因子（图4e）。在小鼠MYC-HCC中，癌细胞迁移（p=6.9 X 10-8）和侵袭性（1.4 X 10-7）等生物学功能被激活，从而证实这些肿瘤具有侵袭性表型（图4f）。总的来说，上述分析证明了小鼠模型的稳健性及其与人肝癌血管侵袭的相关性。

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⑥我们进行了跨物种比较分析，以确定在MYC驱动的小鼠肝癌（n=759）和有血管侵袭的人肝癌（n=87）中富集的保守蛋白。我们发现两组之间有七种蛋白质重叠（图5a-5b）。其中，纤维连接蛋白是两个队列中表达最高的蛋白质（小鼠Fn1 p=1.7 X 10-11；人类Fn1 p=1.5 X 10-4）（图5c，补充图2）。我们通过免疫印迹进一步证实了小鼠MYC驱动的HCC中纤维连接蛋白的过度表达（图5d）。原发性肿瘤的免疫荧光染色显示纤维连接蛋白在MYC-HCC的癌细胞和肿瘤间质中均过度表达（图5e）。此外，间质Fn1表达主要在血管周围和瘤周部位发现，在MYC-HCC的IHC染色上，10%的癌细胞本身表达Fn1（图5f）。

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⑦我们已经证明Fn1在MYC-HCC中过度表达。我们进一步发现了MYC促进纤维连接蛋白转录的机制证据。首先，对Chip-seq实验的荟萃分析显示，在基因转录调控数据库（GTRD）（24）中，MYC结合人类FN1基因上游的多个实例（补充图3a）。第二，在真核生物启动子数据库（EPD）的数据（25）中，模体发现分析在FN1的启动子区域确定了多个MYC结合位点（补充图3b）。第三，利用编码数据库，基于FN1转录起始位点附近MYC结合位点的存在，我们确定FN1是MYC的转录靶基因（26）。最后，我们发现在TCGA泛癌数据库的13个实体瘤中，MYC水平与FN1水平呈显著正相关，包括HCC（补充图3c）。综上所述，这些数据表明MYC转录调控癌细胞中FN1的表达

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5、纤维连接蛋白促进人肝癌细胞侵袭和迁移

①我们评估了纤维连接蛋白在人肝癌中的功能作用。我们分析了来自全基因组CRISPRi和RNAi筛查的癌症依赖图数据，以评估纤维连接蛋白敲除是否影响HCC细胞系的存活或生存能力（27–29）。在20个HCC细胞系中，没有一个在CRISPRi或RNAi筛选中显示出低依赖性得分，这表明FN1对HCC癌细胞的存活或增殖不是必需的（图6a）。
②为了评价FN1在肝癌中的功能作用，我们使用 dicer-substrate 27mer duplex siRNAs 在两个具有中性依赖性评分的肝癌细胞系SKHep1和SNU182中敲除FN1的表达。我们分别用qPCR和免疫荧光法证实FN1 mRNA和蛋白敲除（图6b-6c，补充图4a）。
③由于FN1在人肝癌中被发现与血管侵袭有关，我们用基底膜侵袭试验来评估它是否在癌细胞侵袭中起作用。与对照细胞相比，在Boyden小室试验中，FN1敲除的细胞通过一层基底膜提取物侵入的能力降低（侵入细胞的平均百分比分别为18.3%和64.5%；p<0.0001）（图6d，补充图4b）。

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④我们还发现，在伤口愈合试验中，与对照细胞相比，具有FN1敲除的SKHep1细胞的迁移能力降低（72小时时平均伤口闭合率为40%对92%；p=0.0004）（图6e-6f）。因此，FN1促进肝癌细胞的侵袭和迁移能力。

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6、验证纤维连接蛋白在人肝癌组织中的表达

①探索性跨物种蛋白质组学分析表明纤维连接蛋白是一种与侵袭性肝癌相关的保守蛋白。在TCGA队列中，纤维连接蛋白在肿瘤中的表达不仅与血管浸润有关，而且与更晚期的肿瘤分期（p=0.01）和更高的肿瘤分级（p=0.08）有关（补充图5a）。此外，较高的FN1 mRNA表达与较低的无复发生存率相关（高FN1 7.4个月vs低FN1 21.6个月；p=0.001；HR 2.4，）（补充图5b）。
②为了进一步验证这些发现，我们采用了一组独立的患者，他们的配对HCC样本和周围的非肿瘤性肝硬化组织（n=153）在组织微阵列（TMA）中可用。我们比较了FN1在HCC中的表达与对照组非肝组织（n=18）或瘤周肝硬化（n=153）中的表达。FN1在HCC肿瘤组织中的表达明显高于非肿瘤周围肝硬化组织（染色强度评分H=27.8 vs.H=17.5，p=0.0007）和非肝脏对照组织（staining intensity score H=27.8 vs. H=8.7, p=0.007）（图7a和7b）
③肝细胞癌中FN1表达阳性的细胞百分比高于无肝细胞癌的肝硬化（25.3%对17%，p=0.002）或对照组非肝组织（25.3%对8.9%，p=0.01）。总的来说，28%的HCC FN1低表达，72%的HCC FN1中高表达。此外，我们评估了来自肝癌样本公共存储库人类病理学蛋白质图谱（HCPA）数据库的纤维连接蛋白的蛋白质表达数据（n=12）（30）。与我们的TMA结果一致，纤维连接蛋白在所有HCC肿瘤中均有表达，大多数（75%，n=9）纤维连接蛋白中高表达，25%低表达（补充图6）。这些数据证实，与非癌性肝硬化组织相比，纤维连接蛋白在人肝癌中显著过度表达。
④为了验证FN1表达与肝癌血管浸润之间的关系，我们分析了FN1在一个单独队列存档的人肝癌全层组织（n=12）中的表达，并比较了已知血管浸润的肿瘤（n=6）和无血管浸润的肿瘤（n=6）。两组患者的原发肿瘤分期和肝硬化病因相匹配。与TMA结果一致，与周围非肿瘤性肝组织相比，HCC组织显示出更高水平的FN1表达（H评分8.0 vs.1.8；p<0.001）（图7c-7d）。

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⑤此外，我们观察到有微血管浸润的肿瘤中FN1的表达高于无微血管浸润的肿瘤（H评分8.2比5.8；p=0.001）（图7e-7f）。有趣的是，我们还发现纤维连接蛋白在有血管侵犯的肿瘤微血管内的肿瘤栓塞中持续高表达（补充图7）。这一数据证实了肿瘤FN1的表达与人肝癌的血管浸润有关。

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7、纤维连接蛋白作为晚期肝癌非侵袭性生物标志物

①我们评估了纤维连接蛋白是否可以作为肝癌的无创性血浆生物标志物。为此，我们通过前瞻性招募年龄、性别、种族和肝硬化病因匹配的HCC患者（n=35）和无HCC的肝硬化患者（n=10），进行了一项试点病例对照研究（图8a）。
②与非HCC肝硬化对照组相比，HCC患者血浆纤维连接蛋白水平显著升高（平均值=307.7μg/ml，SEM=39.9）（平均值=41.8μg/ml，SEM=13.3）（p=0.0003）（图8b）。
③相比之下，TCGA队列中HCC组织中升高的另外两种蛋白PAI-1和VEGFR2的血浆水平在HCC患者的血浆中没有升高-
与患者相比单纯肝硬化患者的血浆PAI-1（平均值=4.1μg/ml，SEM=7.1）或VEGFR2（平均值=13.20μg/ml，SEM=3.81）没有升高（8b）
④FN1诊断HCC的敏感性为92%，特异性为88%，FN1值为100μg/ml.什么时候临界值提高到160μg/ml，敏感性下降到88%，特异性提高到100%。AFP敏感性为88%，特异性为40%，临界值为4ng/ml。联合AFP和FN1（联合AUC 0.93（0.84-1.00））比FN1（AUC 0.89（0.79-0.99））或单独AFP（AUC 0.77（0.63-0.90））提高AUC（图8c）。
⑤PAI-1 0.56（95%CI 0.35-0.78；p=0.535）和VEGFR2 0.57（95%CI 0.35-0.78；p=0.596）的AUC较差（图8c）。

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⑥多灶性肝癌患者的FN1水平在统计学上更高（平均377 vs.214μg/ml）（p=0.02），晚期肝癌患者的FN1水平更高（平均T1（n=9）=154 vs T2（n=14）=312 vs T3（n=11）=419μg/ml）（p<0.05）（图8d）。FN1水平没有因肝病的病因而变化（图8d）。
⑦最后，与组织纤维连接蛋白表达一致，肿瘤有血管侵犯的患者血浆FN1水平（平均414μg/ml）高于无血管侵犯的患者（平均258μg/ml）（p=0.04）（图8d）。相反，血清甲胎蛋白（AFP）水平不能预测肿瘤分期（p=0.482）或血管侵犯（0.415）。因此，纤维连接蛋白是一种很有前途的侵袭性肝癌的非侵袭性血浆蛋白质组学生物标志物
图D第三张图看不太懂Etiology of Cirrhosis--肝硬化多灶性
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四、材料与方法

1、TCGAdata

level 3 normalized RNAseq data, level 3 microRNA data and level 3 reverse phase protein array (RPPA) data were downloaded from GDC data portal https://portal.gdc.cancer.gov/

2、差异表达和功能分析

①热图、差异表达分析--Qlucore Omics Explorer v. 2.2；
The ‘mean = 0, var = 1’ setting was used to scale the data
②差异表达的mRNA、microRNA、protein用的QIAGEN’s IPA
QIAGEN’s Ingenuity® Pathway Analysis (IPA®, QIAGEN Redwood City, www.qiagen.com/ingenuity) software was used for pathway analysis and upstream regulatory analysis of differentially expressed genes, microRNAs and proteins.
③将差异基因表达与专有的基因相互作用网络数据库进行比较，以估计给定通路差异富集的可能性。
④IPA中的上游调节因子分析用于根据文献和编入Ingenuity®知识库的数据集预测上游转录调节因子。
⑤生存分析--cBioportal (https://www.cbioportal.org/)

3、统计学

组间差异采用t检验或单因素方差分析（ANOVA）进行分析。分类变量比较采用卡方检验。生存分析采用Kaplan-Meier分析和对数秩检验。