一. 研究背景
使用不同技术生成的大规模单细胞转录组dataset，批次效应特殊的系统变化对批次效应效果的去除和dataset成提出了挑战。随着scRNA-seq数据的持续增长，实现计算器资源的有效批次集成是至关重要的。在这里，作者对批次效应校正算法的基准进行了深入的研究，以确定最适合去除批次效应的算法。
二. 分析流程
三.结果解读
1.使用5个评估指标对十个dataset的14种整合方法进行全面测评
图1 基于10个数据集，使用5个评估指标对14个算法进行基准测试。作者使用t-SNE和UMAP可视化技术，结合kBET、LISI、ASW、ARI和DEG等基准度量来评估14种算法在保持细胞亚群分离准确性的同时进行批次集成的能力。所用的数据集涵盖了人和小鼠不同类型的细胞，如树突状细胞、胰腺细胞、视网膜细胞和外周血单核细胞(PBMCs)等。所使用的技术范围也很广，包括10x、SMART-seq、Drop-seq和SMARTer等。
表1.十四种批次效应校正算法描述
2.不同情形下对校正方法进行评估
2.1 情形一：不同的方法对同一细胞类型的批次校正
- 使用UMAP可视化技术对dataset2（小鼠细胞）进行的14种批次效应校正算法，并对校正结果进行定性评价。
图2. 每种算法下有两行图，第一行是依据细胞批次来着色，在第二行中是按细胞类型来着色。（下文后续的操作类似）
结果显示：Seurat 2,Seurat 3,Harmony和fastMNN等方法降维后亚群聚类情况较好 。
- 使用ASW、ARI、LISI和kBET等四个评估指标对“dataset2”14种批次效应效应校正算法进行定量评估
结果显示，综合对批次集成和细胞亚群纯度的四项指标评估结果中，Harmony算法的排名都比较靠前。
- 使用UMAP可视化对dataset5（人外周血单个核细胞）进行的14种批次效应校正算法，并对校正结果进行定性评价。
图4结果显示： scGen、MMD-ResNet和LIGER的降维后亚群聚类情况较好。
- 使用4个评估指标对dataset5的14种批次效应校正算法进行定量评估
结果显示Harmony、Seurat 3、LIGER去批次效应结果较好。
小结：对于这两个dataset（人PBMCs和鼠细胞图谱），
Harmony、Seurat 3和LIGER是首选的三种算法。
2.2 情形二:每个批次的细胞类型不完全相同
- 利用UMAP对dataset1（人树突状细胞）的14种批次效应校正算法进行评估
dataset1在不同的批次中存在两个高度相似的细胞类型。
对可视化图的检验表明，大多数算法可以将两个批次的细胞混合在一起。不过，limma使两个批次的细胞簇接近，但没有实现混合，而MMD-ResNet和BBKNN无法混合常见类型的细胞簇。
- 使用4个评估指标对dataset1的14种批次效应效应校正算法进行定量评估
结果显示：对于dataset1，综合四项指标，fastMNN是最优的算法，其次是LIGER和scMerge。
- 使用UMAP对dataset6的14种批次效应校正算法进行评估
dataset6只包含两个细胞类型
结果显示scGen、scMerge和BBKNN的降维聚类效果较好。
- 使用4个评估指标对dataset6的14种批次效应效果校正算法进行定量评估
综合4个评价指标来看，Harmony是最优算法，其次是Scanorama和scGen。
- 使用UMAP对dataset7（小鼠视网膜细胞）的14种批次效应校正算法进行定量评价
dataset7的不同批次中，细胞类型很不均匀。
结果显示：ComBat和limma处理后的降维聚类效果较优。
- 使用ASW、ARI、LISI和kBET四个评估指标对dataset7的14种批次效应评估
结果显示LIGER是此次最优的算法，其次是MNN Correct和scMerge。
- 利用UMAP可视化技术对dataset10（小鼠造血干细胞和祖细胞）的14种批次效应校正算法进行定量评价
结果显示：Seurat 2、Seurat 3、Harmony、Scanorama和LIGER处理的降维聚类效果较优。
- 使用ASW、ARILISI和kBET四个评估指标对dataset10的14种批次效应校正算法进行定量评估
综合四个指标来看，Harmony、Scanorama和LIGER是该dataset的较优算法。
小结：
在情形二中，作者在四个不同的dataset上评估了14种批次效应校正算法。
虽然没有一种算法对所有dataset都是最优的，但LIGER是dataset1,7,10的较优算法，而scMerge在dataset1,6,7中排名第三。Harmony在dataset6和10中排名第一，而Scanorama在dataset6和10中排名第二。
基于这些结果，
LIGER是这个情形的较优算法。
2.3 情形三：存在多个批次（测试了多个批次下的批次效应校正能力）
- 使用UMAP可视化技术对dataset4（人胰腺细胞）的14种批次效应校正算法进行定性评价
dataset4的人胰腺细胞包括五个批次
结果显示：Seurat 3、Harmony、scGen和LIGER处理后的降维聚类效果更优。
- 使用ASW、ARI、LISI和kBET四个评估指标对dataset4的14种批次效应效应校正算法进行定量评估
综合四项指标，Seurat 3是较优的算法，其次是scGen和scMerge。
情形2中分析dataset6（也包括了两个以上的批次）中整合效果较好的前几名依次是Harmony、Scanorama、scGen和scMerge。
⚠️所以综合dataset4和6的评估情况来看，作者给出的建议是：
- 对于已标记细胞类型的dataset，建议使用
scGen；- 对于未标记细胞类型的dataset，推荐使用
Seurat 3和Harmony。
2.4 情形四：处理的数据集很大（在两个大dataset上测试这些算法）
- 用UMAP可视化技术对dataset8（小鼠大脑）的14种批次效应校正算法进行定量评价
结果显示：只有LIGER在实现分批混合的同时，保持了较好的细胞类型分离。
- 使用ASW、ARI、iLISI和kBET四个评估指标对dataset8的14种批次效应效应校正算法进行定量评估
综合四项指标显示：最优的是Seurat 3，其次是scGen和Seurat 2。
- 使用UMAP可视化技术对dataset9（人类细胞图谱）的14种批次效应校正算法进行定量评价
dataset9由两个数据批次组成，每个数据批次来自不同的组织。由于缺乏细胞类型信息，只能评估批次混合能力。
- 除了scMerge、limma和Scanorama，大多数算法都能够均匀混合批次。
图19.使用ASW、ARI、LISI和kBET四种评估指标对dataset9的14种批次效应效应校正算法进行定量评估
综合四项指标，排名前三的算法依次是LIGER、ZINB-WaVE和MMD-ResNet。
因此
LIGER、ZINB-WaVE和MMD-ResNet这三种算法都被推荐用于大型的dataset。
2.5 情形五：DEG评估
- 利用模拟dataset和差异基因表达分析评价八种批次效应校正算法
图20A：作者按所示的DEG分析工作流程，对8个算法进行了评估。
使用Splatter包生成6组具有预定义批次效应效果和差异基因表达谱的模拟数据。
使用Seurat包对校正后的数据进行差异基因表达分析。
批次效应校正的矩阵中识别的差异表达基因(DEGs)与ground truth DEGs进行比较，并计算精度、Recall和F-score等指标。
图20B：为图20A中用到的6个模拟dataset，并对drop-out值和批次的情况作了展示。
图20C：计算了上调和下调基因的F-score。根据F-score，MNN Correct，ZINB-WaVE，ComBat和scMerge是表现最好的方法。
简单来说，若想获得一个用于下游分析批次效应校正矩阵的话，
ComBat、MNN Correct、ZINB-WaVE和scMerge是作者推荐的算法。
3. 整合上述分析结果
十四种批次效应校正算法的有效性和效率
图21A：根据ASW、ARI、LISI和kBET指标对算法进行评估，然后使用秩和算法对所有指标进行排序。
山脊线的高度表示不同dataset的rank和score，rank和score越低表示性能越好。即出现在底部的Harmony、LIGER和Seurat 3是总体得分最高的三种算法。
图21B：对于dataset8的十四种算法的内存使用情况。
图21C：展示了14种算法处理时需要的时间。
小结
本文作者基于10个人和鼠的dataset，使用t-SNE和UMAP可视化技术，结合kBET、LISI、ASW、ARI和DEG等基准度量，来评估对14种去批次效应算法的批次效应校正结果。
不同情形下推荐的去批次效应算法总结：
| 情形 | 推荐的去批次效应算法 |
|---|---|
| 不同的技术处理下相同细胞类型的批次 | Harmony、Seurat 3、LIGER |
| 每个批次的细胞类型不完全相同 | LIGER、Harmony |
| 有多个批次 | Harmony、Scanorama、scGen、scMerge |
| 处理的数据集很大 | LIGER、ZINB-WaVE、MMD-ResNet |
| 用于下游分析批次效应校正矩阵 | ComBat、MNN Correct、ZINB-WaVE、scMerge |
| 综合以上 | Harmony、LIGER和Seurat 3 |
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