发表期刊：Microbiome (IF=14.652)
发表时间：2022.2
合作单位：南京农业大学
样本类型：土壤
DOI: 10.1186/s40168-022-01236-9
研究背景
在土壤微生物中，植物生长促进细菌 (PGPB) 是工程微生物组应用于农业的重要环节，包括改善生物控制和植物生长，PGPB 可以加强植物的养分吸收或调节植物激素水平，或通过抑制各种病原体和增强免疫系统或提高抗性来间接影响植物生长环境压力。
凌恩生物客户近期在Microbiome (IF=14.652)发表“Long-term effect of epigenetic modification in plant–microbe interactions: modification of DNA methylation induced by plant growth-promoting bacteria mediates promotion process”研究论文，探究PGPB 接种物对植物发育过程中根际微生物组的影响，对比是否接种根际微生物组之间存在功能差异，以及 DNA 甲基化在 PGPB 介导的植物生长促进中的作用。
实验设计
1、研究对象
美洲商陆的根和根际土壤样本
2、实验处理
空白对照组和 zebularine （Zeb）处理的的2种美洲商陆都被转移到散装（CK)土壤、灭菌（Ste）土壤或接种物（菌株PGP5或PGP41）的4种土壤中，并在移植后0、3、7、15、21和30天采集。
3、研究方法
通过扩增子和宏基因组测序分析美洲商陆根际微生物群在接种后功能水平上的动态变化。同时，通过转录组测序和全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）评估美洲商陆响应 PGP5 和 PGP41 接种的基因表达和 DNA 甲基化变化。用 DNA 甲基化抑制剂 zebularine (Zeb) 处理植物，以进一步研究 DNA 甲基化在促进生长过程中的作用。
图 实验设计
研究结果
1、根际微生物群落组成主要由植物发育驱动
为了探索 PGPB 和植物发育对微生物组组成的影响，作者研究了接种和植物栽培处理后 30 天内根际微生物组的变化。在第 3 天检测到两种接种物（菌株 PGP5 和 PGP41）的高丰度，随后在对照土壤中迅速下降至相同水平（图 1A、B）。α-多样性的揭示了植物发育过程中多样性随时间的变化（图1C-E）。PCoA分析表明处理之间根际微生物组的植物发育依赖性变化趋势一致。总之，根际隔室可能会对根际微生物群具有募集作用，从而在根与特定细菌之间形成密切关系后稳定根际微生物群。
图 1 根系诱导的根际微生物组的分类学差异分析
2、由接种物引起的根际微生物群落变化仅限于早期阶段
研究表明GP41-Day 3 或 PGP5-Day 3 中差异丰富的属主要在早期发挥作用，然后在后期恢复到 CK 水平。此外，在共发生网络图表明早期网络比晚期网络更复杂、连接和紧密。与早期相比，晚期负相关性的增加可能是由于根部吸收了特定细菌，排除了不相关的细菌。总之，结果表明根系募集对根际细菌的持续影响，而接种主要在早期影响根际微生物组成。作者通过宏基因组分析更加深入的分析了根际微生物组之间的功能差异。KEGG和COG功能注释表明，接种处理诱导的根际微生物组的功能水平变化仅限于早期阶段。
图2 接种物诱导的根际微生物组的分类学变化
图3 根际微生物组的功能变化
3、微生物组诱导的根基因表达变化被选择性地维持到后期
作者通过转录组的GO富集分析表明，晚期的大部分富集项也在早期富集，晚期的 DEGs 可能是由于早期接种诱导产生的。GO 富集分析表明，DEGs 参与了“过氧化氢代谢”等过程，都与植物和微生物之间的相互作用有关。加权基因共表达网络分析 (WGCNA) 用于确定具有高度相关表达模式的 DEGs 模块以及根基因表达与根际微生物组的关联。共鉴定出 16 个共表达模块（图 4B），进一步研究发现这些特征由微生物群落的 PCoA 中的三个主要成分所代表，根中DEGs 的表达与根际微生物组高度相关，尤其是turquoise模块（图4C，R = 0.81，P <0.001）。结合在早期也检测到大多数 DEGs 及其在晚期显著富集的功能的结果，这些结果表明微生物组诱导的根基因表达变化选择性地维持到晚期。
图4 根际微生物组诱导的根中基因表达谱的变化
4、DNA甲基化修饰影响根中的基因表达
参与维持 DNA甲基化的基因在接种和未接种根之间在早期显示出显著不同的表达模式，但在晚期则没有。DNA甲基化的分析总共鉴定了14-19百万个甲基化胞嘧啶 (mCs)。关注CHH环境中的 DMR的结果表明，在植物-微生物相互作用期间，某些区域的 DNA 甲基化变化从开始阶段到晚期阶段都保持不变（图 5）。显性 DMR 类型与转录本丰度之间的关系表明，接种诱导的 DNA 甲基化修饰可能参与基因表达的调控。在 PGP5/PGP41 接种的植株和美洲商陆之间的相互作用中，基因转录至少部分受到 DNA 甲基化的控制。
图5 DNA 甲基化组谱的变化及其与基因表达的相关性
5、DNA甲基化的变化与接种诱导的美洲商陆生长促进有关
通过定量PCR（qPCR）量化16S rRNA基因的拷贝数来计算根际土壤和根中接种菌株的丰度，结果表明没有接种物在根部定殖。作者使用无菌土壤进行植物发育和接种处理，每种菌株的接种显著促进了植物生长。这些结果表明，根际微生物组的变化和根中接种物的定殖都不是促进植物生长所必需的。
作者用 DNA 甲基化抑制剂 Zeb 处理美洲商陆的幼苗（图 6）研究 DNA 甲基化在接种诱导的美洲商陆生长促进中的作用，Zeb 处理大大削弱了接种物诱导的植物生长促进作用。总之，接种诱导的美洲商陆生长促进至少部分是由 DNA 甲基化的变化介导的。
此外，作者还在接种后60天检测到接种诱导的美洲商陆的生长促进作用（图6G），这表明早期接种物引起的DNA甲基化改变对接种诱导具有长期影响。
图 6 DNA 甲基化抑制剂处理破坏了由接种 PGP41 和 PGP5 菌株诱导的美洲商陆生长促进作用
综上，作者的研究为微生物-植物相互作用提供了见解，并强调了根中 DNA 甲基化修饰对 PGPB 响应的重要性，提出了 PGPB 诱导的根中 DNA 甲基化修饰促进植物生长的新机制。这为微生物与植物的相互作用提供了重要的见解，并为植物微生物组工程提供了超越维持土壤中接种物持久性角度的新策略。
参考文献:Long-term effect of epigenetic modification in plant–microbe interactions: modification of DNA methylation induced by plant growth- promoting bacteria mediates promotion process
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