非因生物发表国内第一篇空间组学技术综述文章
作为空间组学技术应用的领头羊，非因生物团队近日在《Biotechnology Journal》（IF:4.677）上发表题为“Spatial Transcriptomics and Proteomics Technologies for Deconvoluting the Tumor Microenvironment”的空间组学研究进展的综述类文章（doi:10.1002/biot.202100041.如图1）。
图1
文章分别从空间转录组技术和空间蛋白组技术两方面，简明扼要地介绍了各类空间生物学技术，包括非因数字空间多组学分析技术（DSP）、10X 空间转录组技术（ST）、基于循环免疫荧光的CODEX和Multi-Omyx技术、基于质谱（MS）的成像质谱（IMS）和多重离子束成像（MIBI）技术；同时还探讨了FISSEQ、MERFISH、Slide-seq和HDST等当中一些可能在不久的将来得到广泛地应用的技术（如图2）。文中非因生物结合自身在空间生物学的大量经验，进一步介绍了DSP空间组学技术，讨论了其在免疫肿瘤学中的独特特性及其未来在TME方面研究发展的展望。
图2空间转录组和蛋白组技术示例图
空间转录组学技术
尚未商业化的空间转录组技术：
FISSEQ（原位杂交测序技术）：该技术通过CircLigase将RNA原位转化为cDNA，形成环状结构进行基于滚环扩增（RCA）的信号放大，然后利用基于SOLiD测序技术的多轮共聚焦显微镜进行成像，获取基因原位表达信息。该技术能够对理论上高于16000个基因的RNA物种进行亚细胞研究，但由于信号拥挤且计算量大，因此在技术上具有挑战性。尽管与FFPE组织相容，但可扫描区域局限在4 x 4 mm区域内，且复杂的工作流程很难在实验室施行，限制了该技术的广泛应用，而且对于易污染的rRNA和活性RNA富集，测序偏差也是不可避免的。
MERFISH（多重抗误差矫正荧光原位杂交技术）：该技术工作原理是将基于特殊汉明距离设计的“条形码”分配给细胞的RNA，让它们与DNA探针库杂交，赋予这些条形码意义，然后通过成像读出这些条形码，确定单个RNA分子的特性。并通过多轮成像，同时读出不同基因的原位表达信息。该技术结合原位杂交与在编码探针中改进的MHD4成像技术，可增加对靶标的结合以减少错配。MERFISH技术利用4组探针，单个转录本的总覆盖率高达192bp，可检测超过10000个转录本。然而，它对组织样本的适用性限制相对较高。
HDST（高分辨率空间转录组学）：该技术基于原位透化反转录，并使用“分割池方法”产生高分辨率（2μm）、高密度（数百万）微珠阵列。同时，通过拆分混合形成3段空间定位序列的设计，再结合14（4+5+5）轮荧光指导的探针杂交流程，可以将接近290万个独立空间坐标分配到每一个微阵列中，来实现高精度定位。结合逆转录和原位cDNA生成并结合NGS实现原位表达谱分析。与上述技术相比，HDST明显提高了空间分辨率，同时可检测多达上万重的基因表达，然而仅适用于冰冻切片和de-novo测序的方式仍然对低丰度靶点缺乏敏感性，解析组织范围也相对有限，成本依然很高。
Slide-seq：Slide-seq首先在涂有橡胶的玻璃盖玻片表面填充一层10 μm的特异性条形码微珠（beads）。与其他高通量如scRNA-seq方法中使用的微珠类似，每个微珠上条形码是随机分布的。因此，先对每个微珠上寡核苷酸条形码进行识别，再进行混合测序。Slide-seq后续利用SOLiD原位测序技术来读取每个柱子上不同条形码，并一次形成一套独特的空间定位坐标。在原位表达分析中，首先识别每个10 μm捕获点（spot）中特异性空间标识符，再通过寡核苷酸捕获的mRNAs进行RNA-seq，同时可以映射回它们的原始空间坐标。Slide-seq以单细胞分辨率对150万个捕获点进行测序，然而与HDST相比，Slide-seq的成本更低，所能覆盖的面积更大，同时可以达到单细胞的分辨率。
现已商业化的空间转录组技术：
ST（空间转录组技术）：是一种基于试剂盒的技术，要比HDST少很多复杂的过程。技术的一般流程包括组织包埋、组织切片、固定、H&E染色、亮视野成像、组织通透化、cDNA合成、组织移除、探针释放、文库准备、测序、数据处理、数据可视化和分析。该技术现已广泛应用于TME研究。但该技术仍然存在不足之处，为精确捕获所需靶标，对冷冻切片的处理过程对实验结果影响较大。此外，该技术是在6.5 X 6.5mm区域的芯片上，故TME全局研究受到限制。虽然亚组织分辨率是可以实现的，但丢失点间信息可能会丢失稀有细胞的关键信息。另一个弊端是常见的RNA降解导致的组织不相容性。
DSP（数字空间多组学分析技术）：为弥补上述不足，DSP技术应运而生。该技术将实验与集成系统相结合，利用荧光标记选取兴趣点（Region of Interest, ROI）将需要分析的特定区域通过多色组合的组织形态学标记进行划分，通过微米级高精度UV光解技术将不同ROI上的核酸链解离下来，与捕获探针和荧光探针杂交，通过特有的nCounter分析系统进行计数定量，来实现对每个ROI中表达谱分析（如图3）。DSP技术的另一独特优势在于样本形式广泛，包括FFPE、新鲜冰冻切片、TMA和细胞样本。此外，该技术灵敏度较高，仅60-100个细胞量即可产生可用于分析的数据，而且ROI圈选可与连续切片的HE或IHC染色相结合，对TME分析具有巨大的优势。当然，该技术也存在一定的局限性，ROI选择较为主观，虽然有针对性的方法提高了检测灵敏度和定量的稳健性，但它失去了发现新RNA靶标的潜力。对单细胞分析过程中细胞分型还需要依赖反卷积的算法来实现，但该技术在免疫肿瘤学领域的广泛应用具有前所未有的优势。
图3 DSP的工作流程
空间蛋白组学技术
基于质谱的空间蛋白组学技术：
IMS（质谱成像技术）：是一种非常灵敏的分子成像技术，传统的IMS技术基于基质辅助激光解吸电离质谱仪（MALDI-MS），其中微米级的激光束落在金属基板上制备的组织上。当激光激发点的电离分析物被诱导到质谱分析仪进行肽段识别时，可以通过光栅扫描同时生成组织图像，生成点位置和相关质谱之间的协调数据。虽然该技术可以在几十微米分辨率的基础上实现几十种到一百种蛋白或多肽片段的分析，然而该技术一般通过HE组织染色来指导需要解析的兴趣区域（ROIs），并受制于其分辨率，因此很难对肿瘤微环境的热门区域，如肿瘤浸润淋巴细胞TIL、肿瘤相关巨噬细胞TAM以及三级淋巴结构TLS等微环境亚组织结构进行精确剖析。加之作为非偏倚的质谱蛋白组学技术，无法对肿瘤微环境中的特定兴趣靶点进行基于密度距离的精确定量分析，尤其在靶向药物与免疫药物结合的研究中，不能发挥强大的作用。
MIBI（多重离子束成像）：该技术在一定程度上弥补了IMS缺陷，将空间成像方法与质谱联用，可能有助于在肿瘤微环境精确成像方面达到另一个维度。它使用金属同位素元素作为报告标签来标记抗体，同时检测FFPE组织切片上的多达100个靶标。传统组织学染色可能包括在这个组合内，可实现虚拟组织图像与抗体表达数据的精确重建。然而，该技术检测靶标严格限制在100个，同时极高的硬件造价和同位素标记抗体、特殊的组织固定基质和可选择的同位素种类均限制了该技术的大规模应用。
基于荧光抗体的空间蛋白组学技术：
多种结合循环光谱信号生成的、基于抗体的空间蛋白质组学技术，为TME分析提供另一种可靠的解决方案，在允许条件下，可实现空间单细胞蛋白组学数据整合分析。
CODEX：其核心设计原理是通过每种抗体上标记特异性寡核苷酸“条形码标签”(Barcode), 而不是直接标记荧光染料。成像所需的荧光染料是通过和Barcode互补的寡核苷酸序列特异性结合，使得CODEX突破可见光谱荧光成像通道数量的限制，轻松实现50种或更多蛋白指标的同时检测及分析。而在应用端需要注意的是15.2×15.2mm的可扫描的区域范围限制了对TMA等较大组织样本的广泛应用，而且需要将组织置于盖玻片上进行预处理步骤，增加了实验难度。
Multi-Omyx：是一种超多标多重免疫荧光成像技术，可以在单个组织切片上同时研究多达60个蛋白，通过特殊的荧光擦除技术、背景自荧光矫正，并结合从高内涵成像技术转化而来的高精度连续成像技术对组织样本进行高精度扫描，然后结合HALO人工智能图像识别，对样本区域进行组织分类、定量和密度距离计算等其它基于单细胞研究的分析。技术缺陷是多靶标成像周期较长，随着抗体孵育轮次的增加，抗原抗体结合的免疫亲和力降低甚至丧失，需要经过大量的组织优化实验来实现精准检测。
值得注意的是，非因DSP空间多组学技术采用专有的barcode计数机制，极大的加快了工作流程，3天内可进行12个样本的90个蛋白分析，并可实现与免疫荧光和免疫组化的交叉验证。虽然它并非致力于解决单细胞空间蛋白表达的问题，但其独特的稀有细胞segment分析对TME分析非常重要。该技术具有较高的灵敏性和数据的保真性及准确性，同时如何提升该技术的多重检测能力和灵敏度，以及提升对从有限样本中进行深度亚组织和单细胞的挖掘将会是该技术未来的发展方向。
图4 各种空间生物学技术原理图
图5 转录组和蛋白组的空间生物学技术比较
展望
肿瘤微环境（TME）具有异质性，在肿瘤的发生、转移和耐药中起着重要作用，也是免疫治疗在基础研究和临床转化中的研究难点。实体瘤的复杂微环境囊括了不同细胞亚群之间的直接或间接信号通讯、细胞外囊泡等复杂机制，在临床药物开发中，如何提高实体瘤的免疫治疗效率，精确筛选靶向人群已经成为瓶颈问题。目前的研究已经出现了由空间表型所定义的TME亚型，包括正调控免疫原性表型（免疫炎症型）、免疫原型匮乏型（免疫沙漠型）以及具备潜在的微环境浸润正调控潜力（免疫排斥型）。为了满足免疫肿瘤学研究的需要，高维空间分析技术将会为科学研究和临床转化提供宝贵的数据。
肿瘤微环境（TME）具有异质性，在肿瘤的发生、转移和耐药中起着重要作用，也是免疫治疗在基础研究和临床转化中的研究难点。实体瘤的复杂微环境囊括了不同细胞亚群之间的直接或间接信号通讯、细胞外囊泡等复杂机制，在临床药物开发中，如何提高实体瘤的免疫治疗效率，精确筛选靶向人群已经成为瓶颈问题。目前的研究已经出现了由空间表型所定义的TME亚型，包括正调控免疫原性表型（免疫炎症型）、免疫原型匮乏型（免疫沙漠型）以及具备潜在的微环境浸润正调控潜力（免疫排斥型）。为了满足免疫肿瘤学研究的需要，高维空间分析技术将会为科学研究和临床转化提供宝贵的数据。
鉴于单细胞转录组学和蛋白质组学在解决肿瘤异质性方面的迅速发展，对空间数据信息的需求是不可避免的，而如何结合并运用新的空间组学技术来实现更高维度的挖掘将会是肿瘤微环境研究的下一个新热点。尽管空间组学的应用尚处于起步阶段，但随着该技术越来越多被运用到大量研究中，新的免疫治疗方案和生物标记物的开发、患者分层诊断和新型伴随诊断方法研究以及对耐药机制的深入理解，将会得到前所未有的提升，空间组学将进一步推动我们对TME的深入了解。
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