影响因子：12.4
研究概述：肝癌是全球第三大致癌死亡的原因，也是第六大常见的肿瘤类型。其中，肝细胞癌（HCC）为最常见的肝癌类型，其次为肝内胆管癌（ICC），这两种类型合计占所有肝癌病例的95%以上。在2020年，FDA批准了免疫治疗和抗VEGF组合作为晚期HCC的一线治疗方案。然而，免疫治疗只对20-30%的患者有效。近年来，由于单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组（ST）技术的进步，对基质细胞尤其是纤维细胞的研究兴趣激增。纤维细胞是肿瘤微环境（TME）中最常见的基质细胞类型，通过作为TME重塑的关键参与者，它们在调节抗肿瘤免疫细胞的浸润和功能方面发挥着至关重要的作用。此外，它们还通过多种途径促进肿瘤细胞的生长、转移和药物抗性。促进肿瘤的纤维细胞，被称为癌相关纤维细胞（CAFs），为癌细胞提供了一个肥沃的环境，类似于肿瘤“种子”的“土壤”。当前化疗和免疫治疗方法的一个弱点是: 大多数现有疗法针对的是快速增殖的肿瘤“种子”，但大多忽略了纤维细胞或肥沃肿瘤“土壤”的贡献。由CAFs产生的细胞外基质（ECM）经历主动重塑和降解，促进肿瘤进展，这主要由肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和基质金属蛋白酶介导。ECM的产生和降解的平衡不仅影响细胞迁移和免疫细胞浸润，还调节细胞信号过程。由CAFs分泌的增加和重组的ECM蛋白导致纤维胶原沉积增加，从而导致ECM硬化，进一步促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。已有文章显示CAFs和TAMs在包括肝癌在内的各种肿瘤中具有广泛的细胞相互作用。它们与ECM的重塑密切相关，促进肿瘤结缔组织的形成，抑制淋巴细胞的浸润。然而，肝癌中CAFs和TAMs的异质亚型仍然特征不明确，需要进一步研究以确定。因此，本研究作者旨在揭示了CAFs和TAMs在不同肝脏中的相互作用和异质性，为免疫疗法耐药提供见解。具体研究流程如下：
研究结果：
HCC和ICC中成纤维细胞和巨噬细胞增加
为了阐明各种肝癌类型及样本来源的细胞组成，作者纳入156个scRNA-seq样本作为发现队列，包括14个邻近肝脏组织（AL）、82个HCC、31个ICC、9个联合肝细胞-胆管癌（CHC）、10个继发性肝癌（SLC）和10个外周血（PB）样本。经过标准细胞过滤和处理后，共获得1,034,073个细胞（AL来源83,154个，HCC来源606,191个，ICC来源174,853个，CHC来源46,210个，SLC来源59,077个，PB来源64,588个）和15种主要细胞类型（图A）：B细胞（n=36,685）；CD4+ T细胞（n=196,129）；CD8+ T细胞（n=206,952）；树突细胞（n=17,369）；内皮细胞（n=82,342）；成纤维细胞（n=48,286）；γδT细胞（n=13,760）；肥大细胞（n=2,459）；单核细胞（n=19,755），组织来源的单核样巨噬细胞（n=20,191）；单核样树突细胞（n=1,223）；巨噬细胞（n=129,766）；嗜中性白细胞（n=59,099）；自然杀伤细胞（n=59,099）；肿瘤细胞（n=191,282）。随后，作者对不同样本类型的主要细胞类型的浸润进行了比较分析发现，与AL相比，所有肝癌类型的成纤维细胞和巨噬细胞的偏好和比例普遍增高（图B）。在两种主要的肝癌类型HCC和ICC中，成纤维细胞的富集程度最高（图B）。在HCC和ICC中与AL相比观察到成纤维细胞和巨噬细胞的显著增加（图C）。为了进一步观察成纤维细胞在塑造肝癌微环境中的关键作用，作者参考了先前报道的成纤维细胞亚型特异性标记，并将其分类为八个簇（Fb_01_ADIRF、Fb_02_APOC1、Fb_03_FAP、Fb_04_HLA-DRB1、Fb_05_PLVAP、Fb_06_TOP2A、Fb_07_CFD、Fb_08_GPM6B）（图D）。与邻近正常肝组织相比，所有肝癌类型中Fb_03_FAP的富集程度最高，约占所有成纤维细胞的50%（图E）。相比之下，Fb_04_HLA-DRB1在AL中表达最高（图E）。为了阐明这些不同亚型的成纤维细胞的功能，作者根据每个细胞亚群的高表达基因进行了功能富集分析（图F）。具体而言，Fb_01主要在与肌肉系统和肌肉收缩相关的通路中富集。Fb_02在与脂质相关的通路中富集。Fb_03属于与基质相关的成纤维细胞，在细胞外基质组织和胶原纤维组织中显著富集。Fb_04涉及抗原处理和呈递，高表达MHC II类分子HLA-DRB1和趋化因子CXCL12。Fb_05富集在内皮发育和内皮细胞分化通路中，暗示其可能通过内皮-间质转化来源于内皮细胞。Fb_06的特征是高增殖性，属于周期性CAFs。Fb_07的表达基因与Fb_03相似。此外，Fb_08富集于与神经相关的通路，高表达S100B和GPM6B，属于纤维母细胞样周围神经细胞。接下来，作者进一步评估了HCC和ICC中成纤维细胞亚型的浸润差异，与AL相比，FAP+ CAFs在HCC和ICC中显著增加（图G）。FAP+ CAFs的关键特征包括高度激活的血管生成、胶原纤维组织和胶原生物合成过程（图H）。为了进一步验证肿瘤微环境中FAP+ CAFs的稳定增加，作者整合了包括79个样本的单细胞验证队列，显示了从AL、HCC到ICC，FAP+ CAFs的比例逐渐增加（图I）。最后，免疫组化也确认了HCC和ICC样本中FAP表达的增加（图J）。
FAP + CAFs升高提示肿瘤进展
接下来，作者首先在发现单细胞队列中评估了细胞比例与患者风险之间的关系。作者发现Fb_03_FAP和Fb_08_GPM6B与患者总生存期（OS）的不良预后显著相关（图A）。在临床指标评估中，高浸润的FAP+ CAFs与肝癌患者较差的OS、淋巴结转移、远处转移以及高级别相关（图B）。为了整合和分析批量RNA-seq数据与单细胞数据，作者使用了Scissor算法来研究细胞与患者生存的关联。基于TCGA批量RNA-seq和生存数据，作者识别了与较短OS相关的来自成纤维细胞的Scissor+细胞（图C），这一发现在单细胞发现队列中得到了进一步验证（图D）。通过评估不同样本类型中的细胞比例，与HCC样本相比，Scissor+细胞在ICC中更高（图E）。值得注意的是，FAP+ CAFs构成了Scissor+细胞的一个重要组成部分，特别在细胞亚型比例分析中占了显著的72%（图F）。与FAP+ CAFs一样，Scissor+细胞也表现出与血管发育相关基因（SEPRINE1、VEGFA、CXCL8、THBS1）的高表达，这些基因更倾向于在ICC中高表达。此外，在五个独立的批量RNA-seq队列中，高FAP+ CAF特征评分被发现能预测患者较差的OS（图G）。为了探索FAP+ CAFs的起源，作者进行了拟时序分析来模拟成纤维细胞的分化，发现Fb_03和Fb_02位于两个分化轨迹的末端（图H）。Fb_02主要源自平滑肌细胞或肌成纤维细胞（Fb_01），而Fb_03可能源自肝星状细胞（Fb_04）。
FAP+ CAFs与TAMs的空间共定位
为了识别与FAP+ CAFs交流的主要巨噬细胞亚型，作者对巨噬细胞进行了亚型标注，并鉴定出八个主要细胞亚型。这些包括血液中表达经典CD14和非经典CD16的单核细胞以及六种组织巨噬细胞亚型（图A）。作者把空间转录组和单细胞测序一起嵌入随机森林模型预测中，将FAP+ CAFs和不同类型的巨噬细胞映射到空间组织图像上。在HCC样本中，Fb_03_FAP与Mph_03_DAB2的空间共定位能力最高，而在ICC样本中，Fb_03_FAP与Mph_04_SPP1的空间共定位能力最高（图C）。在细胞比例方面，Mph_03_DAB2在HCC切片中占比最高，而Mph_04_SPP1在ICC切片中占比最高（图D）。这一发现与scRNA-seq的结果一致（图B）。进一步的空间细胞注释揭示，FAP+ CAFs与TAMs在HCC边界共定位，在ICC组织中分散，并且共定位点总是富集在与细胞外基质上（图E）。这一观察与免疫荧光的发现一致（图F）。总之，作者的发现表明，DAB2+和SPP1+巨噬细胞是肝癌中的主要TAMs。DAB2+ TAMs在HCC中富集，与肿瘤边界的FAP+ CAF表现出显著的空间共定位，并可能参与塑造TME。
FAM109B与免疫细胞浸润及LGG肿瘤微环境的相关性
为了进一步研究FAM109B在胶质瘤中的潜在作用，作者计算了TCGA数据集中24种免疫细胞类型的浸润水平。结果显示，FAM109B表达与巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、细胞毒性细胞及活化树突状细胞浸润水平呈正相关，而与浆细胞样树突状细胞（pDC）浸润水平呈负相关（图A-B）。此外，单细胞测序分析表明，FAM109B主要在巨噬细胞中表达（图C）。通过分析FAM109B与巨噬细胞M1（IL12A、NOS2、PTGS2、CCL3和TNF）和M2（TGFB1、IL10、CD163和CSF1R）亚型标志物之间的相关性，结果显示FAM109B与M2型标志物呈正相关（图D）。接着，作者分析了FAM109B与免疫检查点（ICs）之间的关系，发现FAM109B与TCGA和CGGA数据集中大多数ICs呈正相关（图E），并对八个主要免疫检查点进行了详细分析（图F）。
TAMs通过细胞通讯增强FAP+ CAFs的功能
FAP+ CAFs与TAM之间显著的关联和空间共定位特性促使作者进一步探索它们潜在的细胞通讯模式。首先，作者使用FAP+ CAFs作为接收器，调查TAM影响的功能调节（图A）。结果发现大多数配体和受体基因通常与患者生存期较差相关，这意味着TAMs与FAP+ CAFs之间的相互作用可能促进肿瘤发展。同时，作者发现FAP+ CAF中的靶基因主要涉及血管发育、细胞外基质、含胶原的细胞外基质以及对生长因子刺激的细胞反应（图B）。来此外，一些巨噬细胞亚型特异性基因被识别出来，可能在CAF功能调节中起重要作用，如ADM在Mph_SPP1中高表达，其靶基因涉及与缺氧、血管生成和血管相关平滑肌细胞增殖调节相关的通路（图A-B）。接下来作者检查了PDGFB的相应受体，发现PDGFRB、LRP1和PDGFRA在FAP+ CAF中高表达。进一步的空间表达分析显示，PDGFB与这些受体的表达高度空间接近，并在HCC边界富集（图C-D）。最后，作者量化了TAM对FAP+ CAFs的信号强度（称为LRscore），以调查其与泛癌患者预后的关联。在五个独立的肝癌队列中，更高的LRscore一致预示着患者更短的生存期（图E）。
泛癌和临床评估FAP+ CAFs和DAB2+ TAMs研究表明，DAB2+/SPP1+ TAMs是肝癌中的主要TAMs，多项研究报告了SPP1+ TAMs参与促进肿瘤微环境的形成。FAP+ CAFs与DAB2+ TAMs之间的相互作用可能对肿瘤边界处囊性结构的形成至关重要。为了评估FAP+ CAFs和DAB2+ TAMs在泛癌中的潜在重要性，首先需要明确这两种细胞类型在不同肿瘤样本中的浸润丰度。通过分析来自11个器官的scRNA-seq数据，作者观察到FAP+ CAFs和DAB2+ TAMs在正常（n=25）、邻近（n=60）和肿瘤（n=220）样本中的比例逐渐增加（图A-B）。接下来作者在TCGA的RNA-seq数据探讨了这些细胞类型对泛癌患者生存的影响。基于基因表达和Cox风险分析，作者发现FAP表达在大多数癌症（73%）中显著上调，DAB2表达在近半数癌症（41%）中显著上调，这两个基因的高表达通常预示着患者较差的OS（图C-D）。在免疫治疗无反应患者的HCC ST切片中，发现FAP和DAB2在肿瘤边界集中，有效阻断了T/B细胞的浸润。然而，在有反应的患者中，未观察到此类富集，有利于T/B细胞的有效浸润（图E）。这一趋势在其他各种肿瘤类型中也很明显（图F）。高水平的FAP+ CAFs和DAB2+ TAMs与患者对免疫治疗的无反应性相关（图G-I）。这表明FAP+ CAFs和DAB2+ TAMs之间的相互作用可能作为免疫治疗反应的预测因子。
最后，为了评估FAP和DAB2的临床意义，作者进一步包括了90个HCC肿瘤边界样本进行免疫组化（IHC）染色，其中FAP+ CAFs和DAB2+ TAMs在肿瘤核心周围富集（图A）。通过基于FAP或DAB2染色的平均光密度对患者进行分组发现，FAP水平升高的患者或DAB2水平升高的患者显示出降低的OS。结合两个标记提供了更好的区分性能（图B-C）。此外，FAP和DAB2的染色强度还与肿瘤大小和患者血清AFP浓度显著正相关，表明它们有潜力作为临床实践中肿瘤进展的指标（图D）。
研究总结：
总的来说，这篇单细胞文章思路非常清晰，通过深入分析TAMs和CAFs在肝癌微环境中的角色，不仅阐明了这些细胞如何通过相互作用促进肿瘤进展，而且还揭示了其在不同肝癌亚型中的分布和功能差异。研究通过整合单细胞与空间转录组数据，系统地描述了这些细胞如何在肿瘤边界形成免疫排斥的屏障，为未来的治疗策略提供了靶向这些细胞通讯的潜在途径。此外，该文通过与临床数据的关联分析，进一步验证了这些细胞类型在预测患者预后和响应免疫治疗方面的重要性，为肝癌治疗提供了新的视角和策略。
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