学习小组Day7笔记-梦幻天堂

今天学习测序相关知识

学习内容

1. 怎么区分一二三代测序

2. 二代测序大体流程

3. NGS组学都包括哪些分类（粗略）

测序原理和过程

原理介绍视频：https://share.weiyun.com/5qojuBY 密码： 密码：bxsry4
文章《测序的世界》：https://www.jianshu.com/p/101c14c3a1d2

• 一代测序-Sanger法测序（准确，慢，成本高,至今仍是测序行业的金标准。）

Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列

• 二代测序-大规模平行测序（不准确，快，成本降低）

illumina公司最优，原理

1. DNA待测文库构建
2. 簇的创建
3. 桥式PCR扩增及变性
4. 测序

测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（如同Sanger测序法）。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换，目前它的测序错误率在1%-1.5%之间，测序周期以人类基因组重测序为例，30x测序深度大约为1周。

• 三代测序-单分子测序技术（SMRT不准确，纳米技术准确，成本低，快）

与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。 DNA聚合酶和模板结合,4色荧光标记 4 种碱基（即是dNTP）,在碱基配对阶段,不同碱基的加入,会发出不同光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。

一二三代测序对比，引用自生信星球

组学分类

• 基因组学（核酸序列分析）

（1）全基因组测序（WGS）
（2）全外显子组测序（WES）
（3）简化基因组测序（RRGS）
①RAD-Seq基因组作图（遗传图谱、物理图谱、转录本图谱）
②GBS核苷酸序列分析
③2bRAD基因定位
④ddGBS（也就是ddRAD）基因功能分析
（4）以全基因组测序为目标的结构基因组学
（5）以基因功能鉴定为目标的功能基因组学

• 转录组学（基因表达分析）

（1）mRNA-Seq
（2）IncRNA-Seq（长链非编码RNA）
（3）sRNA-Seq（主要是miRNA-Seq）

作用：
（1）获得物种或者组织的转录本信息
（2）得到转录本上基因的相关信息，如基因结构功能等
（3）发现新的基因
（4）基因结构优化
（5）发现可变剪切
（6）发现基因融合
（7）基因表达差异分析

• 蛋白组学

作用：
（1）蛋白质组数据处理、蛋白及其修饰鉴定
（2）构建蛋白质数据库、相关软件的开发和应用
（3）蛋白质结构功能预测
（4）蛋白质连锁图

• 代谢组学

（1）代谢物指纹分析
（2）代谢轮廓分析

测序发展史：150年的风雨历程

【陈巍学基因】Illumina测序化学原理（讲的很好，小白能听懂）

视频概要：
芯片表面有8个通道，上面都做了化学修饰，两种DNA引物通过共价键种在玻璃表面（不会被冲掉flowcel）。
DNA文库：加了接头的DNA（打断，加A，加接头）。
桥式PCR：将加了DNA文库结合在芯片上扩增（接头盒玻璃表面引物互补），然后NaOH解链，然后再结合接头扩增，解链，扩增。。。
测序：带荧光的dNTP确定碱基
Index：文库中加了特定的序列，每个样本加一个。标记样本来源。
双端测序：正负向各测一遍

思维导图 测序入门知识.png