细胞成骨诱导分化实验

成骨诱导

鉴定某个细胞是否是干细胞，或者检测细胞的分化潜能，利用茜素红染色更简单直观，其原理是间充质干细胞向成骨细胞分化的过程中,在细胞表面沉积钙盐,形成钙结节,钙离子与茜素红螯合,被染成红色。

诱导实验步骤

1. 培养容器包被，0.1%明胶在培养箱中孵育30分钟，

除了明胶，还可以用多聚赖氨酸或者血清包被。

2. 接种诱导细胞：取对数生长期的细胞，按照2×10^4cells/c㎡的细胞密度接种至包被后的培养器皿中，于37℃，5% CO₂培养环境下培养至汇合度60-70%，弃掉上清，加入成骨诱导分化培养基。

诱导前的汇合度并不是一成不变的，对于生长快的细胞，汇合度60-70%时诱导能避免细胞密度过高导致的细胞卷边漂起或者状态不佳。当细胞生长速度比较慢时，细胞汇合度可控制在90%左右。

3. 细胞分化诱导：每2-3天更换成骨诱导培养基，于37℃，5% CO₂培养环境下培养约14-21天，并注意观察细胞形态变化。根据细胞钙盐结晶析出和钙质结节形成的情况，决定终止细胞诱导的时间，进行染色鉴定。

注意事项：

（1）加入诱导培养基，3天换一次液，换液注意预热，加液时尽量不要碰到底部的细胞，可以留少量培养基作为缓冲，避免加液时孔板底部缺了一个角，或者卷边。

（2）发现培养基稍微浑浊，可能伴随少量钙结节的出现，尽量不要晃动，换液从上到下轻轻吸，因为钙盐会更倾向于沉积到底部。对于可能分化效果不好的细胞，可以进行2天半量换液。

（3）持续诱导至适量钙盐结节，并不是钙结节越多越好，建议在能看到细胞轮廓，上层有钙结节时终止诱导，覆盖在细胞上层一层灰状物质，染色后会出现红色。

诱导过度的图片

4. 细胞固定：吸去培养基使用适量1×PBS清洗一次，弃去后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面，室温固定30-60 min，弃去固定液再使用1×PBS清洗两次。

5. 茜素红染色：加入适量茜素红染液染3~5min，吸去茜素红染液，用1×PBS清洗两次，并加入适量1×PBS避免细胞干燥。诱导成功时，钙质结节会与茜素红染料结合后呈现红色或橘红色。

6. 诱导评估：显微镜下观察成骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。

诱导实验案例

案例1：MC3T3-E1 Subclone 14细胞成骨诱导分化实验

从克隆的但是表型各异的MC3T3-E1细胞系中分离出一系列亚克隆，从含抗坏血酸培养基生长的成骨细胞中选择高或低成骨细胞分化、矿化的亚克隆。MC3T3-E1 Subclone 14在抗坏血酸和3-4mM无机磷酸盐中生长表现出高水平的成骨细胞分化能力。

所使用的细胞和试剂：
1. 小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14（MC3T3-E1 Subclone 14）货号：TCM-C743
2. HyCyte™ MC3T3-E1成骨诱导分化培养基  货号：EOMX-D101

案例2：成人脂肪间充质干细胞成骨诱导分化实验

脂肪间充质干细胞（Adipose Derived Stem Cells， ADSC）是来源于脂肪组织的多能干细胞。具有自我更新和多向分化能力，在合适的诱导条件下，能在体外被诱导分化为成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等细胞类型。

所使用的细胞和试剂：
1. 成人脂肪间充质干细胞（ADHX-C106）
2.HyCyte™成人脂肪间充质干细胞成骨诱导分化培养基（ADHX-D101）

常见问题

一. 成膜翘边，成团

控制细胞汇合度、明胶包被

诱导过程细胞成片状膜脱壁

二. 许多碎片

可能是污染、或者是膜被吹散、培养基偏黄，没有及时换液导致。

1. 一般诱导过程会历时14-21天，甚至3周往上，实验组一直是处于操作的状态，是很容易有污染的风险，需要在无菌操作上更加注意。

2. 这些碎片也有可能是成膜的细胞导致的，当我们在操作换液的时候可能力度过大导致膜变成碎片。

3. 3天换一次液，但每天也需要看一次，当发现培养基金黄了，需要及时换液。

三. 底部贴壁细胞出现收缩聚集现象，部分视野出现空斑，或者细胞飘了碎了

成骨培养基相对来说是比较温和的，但相对于完全培养基还是有一定刺激性，细胞可能会出现某个视野下没有细胞，某个视野下细胞比较聚集的情况，或者是很多细胞飘了，可能是诱导液对于细胞来说比较刺激，如果出现上述情况，可以换回完全培养基，待细胞状态稍稍恢复，再加入诱导液继续诱导。

四. 染色后的常见问题

1.异物

（1）染色前，尽量用无钙镁的PBS清洗干净，此外需要过滤茜素红，或者将茜素红进行离心。

（2）不能用自来水冲洗，需要用无钙镁的PBS清洗，染色后清洗需要尽量洗干净背景。

2. 整体偏红，还有小颗粒：可能是没有洗干净，需要再次清洗。

3. 红色比较淡，背景比较白或者只有少量钙结节。

钙结节不够多，需要继续诱导，或者是诱导过程中钙盐随着换液丢失。

4. 染色不均

（1）可能是铺板密度不均，铺板不均匀可能导致分化不均匀、分化比例低、分化过程中细胞漂浮等问题。

（2）或者是加液时一直在一个方向加液，有可能导致这个部位的钙盐被吹走，从而染色不均匀。