这次是文献对比阅读，是类风湿性关节炎（RA）相关的两篇文章：一篇是2017年发表在Nature子刊Nature communications的Functionally distinct disease-associated fibroblast subsets in rheumatoid arthritis一文，IF12.35；另一篇是2019年5月正式发表在Nature的通讯论文Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis，IF43.07。

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两篇文章的研究问题都是RA滑膜组织中成纤维细胞的异质性及其与RA病理过程的相关性。这次文献阅读重点在对比两篇文献的研究设计和研究思路。

第一篇文章是研究RA患者滑膜成纤维细胞是否存在异质性，以及成纤维细胞亚群比例变化与疾病之间的关系；

第二篇文章则是先从患者分离的滑膜组织以及体外培养成纤维细胞发现某一分子FAPα在炎症期高表达，推测表达该分子的成纤维细胞极有可能是致病细胞表型，通过一系列实验发现表达FAPa的成纤维细胞内部存在异质性，并发现不同类型FAPa+的成纤维细胞与RA的两种病理过程：炎症及关节破坏之间的关系，然后再验证不同成纤维细胞对应的不同功能，介导不同病理过程。

文1研究思路 文2研究思路

一.一切都是套路：

仔细阅读还是可以看出两文之间存在不少共同点，同时也是单细胞研究的一些套路：

1.发现异质性：流式细胞分选技术+单一细胞亚群的转录组分析+未分选直接进行单细胞转录组测序（无监督聚类分析）+组织免疫组化

两篇文章都是通过已知的成纤维细胞表面标记物作为抗原，通过流式细胞分选人为分选为不同的细胞亚群；关于纯化后的成纤维细胞亚群，文1同时选择了基因芯片+bulk RNAseq技术进行了各细胞亚群间的差异表达基因分析，两者相互验证，文2则是直接bulk RNAseq，生信方面都用了PCA分析，将相似细胞聚类；而单细胞测序方面，文1选择了单细胞测序+表面蛋白标记物分选进行LDA分析，验证异质性存在，文2则是单细胞测序+常规tSNE聚类分析+GO分析，与bulk RNAseq的转录表达情况进行对比，说明异质性存在且细胞亚群功能不同。

2.发现致病细胞亚群：选择合适对照+流式分选+疾病相关性分析

首先说一下为什么选择OA作为对照，因为OA（骨关节炎）的病理机制主要是骨关节破坏，而RA是自身免疫性炎症疾病，除了OA类似的骨关节破坏过程，还出现自身免疫异常引起的炎症，所以对关节炎症这一过程的研究来说，OA比起普通健康对照，更容易发现炎症相关的病理机制。

流式分选结果对比，判断OA和RA成纤维细胞各细胞亚群比例是否存在差异，发现可能的致病的成纤维细胞表型：THY1+细胞，然后将其与疾病各项指标进行相关性分析：文1是滑膜炎症细胞浸润程度、krenn炎症评分（局部炎症）、超声下滑膜增生程度评估以及病程，文2是krenn炎症评分（局部炎症）和ESR(全身炎症）。从而确定了该细胞亚群确实在RA致病过程中起重要作用。

3.发现不同细胞亚群介导不同病理过程：单细胞测序GO分析+bulkRNA测序差异基因表达分析（GSEA分析）+体外功能验证实验（体外刺激、体外共培养、transwell）+体内疾病表现相关性分析（滑膜肿胀程度、炎症细胞浸润程度、关节破坏程度）

个人觉得在这一点上，文2要优于文1，当然，文2砸的钱也更多，因为要构建各种动物模型进行体内验证哈哈哈。文1 选择了做GSEA分析，然后再进行相应的功能验证：细胞增殖做了ki67染色，炎症因子分泌做了体外刺激+ELISA试验以及单核细胞招募试验，破骨细胞生成做了体外共培养，细胞迁移做了transwell。而文2除了常规的体外功能验证实验之外，还用小鼠模型进行了体内验证，给RA小鼠模型进行了关节注射不同细胞亚群对比临床表现。从而确定了不同细胞亚群在体内是否一样起到不同作用。

二.我们不一样：

其实最大的不同就是文1研究对象是患者，文2研究对象是RA小鼠模型——患者，这也是文2的研究手段更加丰富，可操作性更强，特别是在证明假设：FAPa+成纤维细胞与RA的病理过程相关，文2的研究设计都十分严谨：

1.正向验证：通过对比STIA小鼠模型和健康小鼠上，从蛋白、mRNA和细胞数量三个水平说明了FAPa+细胞的疾病相关性

2.反向验证：在构建的自限性和持续性关节炎的小鼠模型上，通过注射白喉毒素靶向杀伤FAPa+细胞从疾病三个病理过程（关节肿胀程度、关节破坏程度、炎症细胞浸润）上证明了清除FAPa+细胞可以减轻病情。同时通过对比不同注射时间，注射部位对关节炎病情的影响。个人觉得FAPa+-荧光素酶-DTR这个转基因小鼠模型的设计真是妙啊，至少在患者身上肯定是无法实现的。

到这里两步已经证实研究假设：FAPa+成纤维细胞介导RA的炎症和骨关节破坏过程，同时相关性分析发现了细胞亚群功能异质性。

3.正向验证2：通过给STIA小鼠模型和CIA小鼠模型两种RA模型关节注射不同细胞亚群比较关节炎症和破坏情况，进行体内功能验证。

4.由鼠到人的推论：人、鼠滑膜组织成纤维细胞单细胞测序tSNE分析+HC分析证实两个物种间成纤维细胞亚群之间的同源关系，说明在人也可能具有相同结论。

三.你爸爸还是你爸爸：

来说说为什么文2能发在Nature原因：

1.课题组钱多

怎么说呢，文2发在Nature还是有原因的，在小鼠模型上应该至少用了近百只小鼠，人滑膜组织的单细胞测序20例+鼠滑膜组织单细胞测序3例，加上转基因小鼠模型设计，可以说是钱砸出来了，不过单细胞测序不都是用钱砸出来的吗

2.动物模型设计巧妙

脱了高大上的单细胞测序的外衣，再看文2第一部分的RA小鼠模型相关实验，设计严谨，利用转基因小鼠以及抗体-抗原原理定向清除FAPa+成纤维细胞进行反向验证其功能。

3.细胞功能验证：体外——体内

相较RA患者，首先局限于伦理，体内验证无法实现；但是动物体内实验还是可操作的，也排除了体内外环境变化带来的干扰。

4.由鼠到人：推广和适用性

通过人鼠单细胞测序鉴定的细胞亚群之间进行HC分析，确定两个物种成纤维细胞亚群之间的同源性，使研究结论具有适用性。

5.研究意义重大：

目前RA的药物研究主要还是在靶向抗炎治疗，对于骨关节破坏的过程以及致病的成纤维细胞尚缺乏靶向治疗策略。这一研究说明成纤维细胞确实参与致病过程，且不同细胞亚群对应不同的致病过程，针对患者表型可以靶向针对成纤维细胞不同亚型治疗，从而弥补了抗炎治疗之外的空白。尽管目前尚没有针对成纤维细胞的药物。

四.最后说说个人觉得继续完善的部分

mmm个人觉得患者部分还是可以继续完善的：比如对比临床表现关节炎症较重骨破坏轻的患者和关节炎症较轻骨破坏炎症的患者滑膜组织成纤维细胞亚群比例是否存在差异，人滑膜组织成纤维细胞单细胞测序也应当完善GO、KEGG分析，比较人鼠成纤维细胞差异。另外，毕竟RA是自身免疫性炎症，既然成纤维细胞亚群对炎症细胞浸润有影响，后续可以对滑膜组织以及外周血的免疫细胞异质性继续进行研究。