专题一：细胞死亡——自噬

专题一：细胞死亡——自噬

1.分类

①巨自噬：细胞整个区域被包围在双膜小泡的自噬体中→自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，内容物被其中的酶降解；

②微自噬：由受损细胞器表面信号分子触发，细胞器或内含物的囊泡直接与溶酶体融合、酶降解；

③选择性自噬（伴侣介导的自噬）

2.判断特征

胞浆空泡化，自噬体形成，溶酶体清除物质。

3.涉及经典通路

1）PI3K-AKT-mTOR信号通路；

2）AMPK-TSC1/2-mTOR信号通路；

4.表征方法

①电镜观察，如GFP-mRFP/LC3双荧光系统观察（一种质粒或慢病毒过表达带两个融合蛋白的LC3）；

②WB/IF/IHC检测自噬相关蛋白（Lamp-2/LC3-Ⅰ/Ⅱ/p62等）表达；

5.诱导剂与抑制剂

1）诱导剂

①模拟内质网应激：Bredeldin A/Thapsigargin/Tunicamycin；

②制造饥饿：Earle's平衡盐溶液；

③PI3K通路抑制剂：C2-ceramide；

④mTOR抑制剂：Rapamycin；

2）抑制剂

①自噬体形成抑制剂：主要为PI3K通路抑制剂（3-MA，Wortmannin，LY294002）；

②自噬体与溶酶体融合阻断：巴伐洛霉素A1、长春碱、诺考达唑等；

③自噬溶酶体降解抑制：主要为蛋白酶抑制剂（E64d、Pepstatin A)；

6.自噬标志物LC3蛋白

①来去动态过程

第一步：LC3/Atg8被具有蛋白内切酶活性的Atg4在羧基端剪切，得到LC3-Ⅰ，分布于胞质中；

第二步：LC3-Ⅰ与Atg7（E1样酶）、Atg3（E2样酶）发生泛素化反应，耦联磷脂酰乙醇胺，生成脂质化的LC3-Ⅱ；

第三步：LC3-Ⅱ附着于自噬体膜上，作为自噬体结构蛋白；

第四步：位于自噬溶酶体外膜的LC3-Ⅱ被半胱氨酸蛋白酶Atg4B移除后回收，位于自噬溶酶体内膜的LC3-Ⅱ与包裹的内容物一起，被溶酶体降解；

第五步：总之，LC3-Ⅰ和Ⅱ之间存在的生成-降解动态过程与自噬体的生成-融合-降解的过程（也叫自噬流）息息相关；单时间点LC3Ⅱ表达改变不能体现自噬改变，需使用阻断溶酶体降解的药物（氯喹、巴弗洛霉素A1等），判断在干预手段下，细胞自噬程度变化。

注：氯喹可升高溶酶体pH值，抑制LC3Ⅱ降解，阻断溶酶体功能；巴弗洛霉素A1作为强效V-ATPase抑制剂，阻断溶酶体依赖的降解。

②LC3的四个亚型

LC3A、LC3B、LC3B2、LC3C，各自表达因组织或细胞类型而异，需根据使用的细胞系或组织情况选择合适的靶标抗体。

③LC3-Ⅱ积聚变化的含义

LC3-Ⅱ增多代表自噬形成增加，LC3-Ⅰ增多代表自噬减弱。