今天跟大家分享的是最近发表在Frontiers in Oncology上的一篇文章，影响因子4.848。
Comprehensive In Silico Analysis of a Novel Serum Exosome-Derived Competitive Endogenous RNA Network for Constructing a Prognostic Model for Glioblastoma
新型血清外泌体竞争性内源RNA网络的计算模拟分析，用于建立胶质母细胞瘤的预后模型
首先让我们通过摘要了解下这篇文章的主要内容，胶质母细胞瘤（GBM）是具有最高死亡率的最具侵略性的脑肿瘤之一，肿瘤衍生的外泌体为GBM肿瘤发生，转移和治疗耐药性的机制提供了新的见解。那么在这篇文章中作者建立了ceRNA网络来构建GBM预后模型并进行了验证。好啦~让我们来看一看作者具体做了哪些研究吧~
一.材料和方法
1.1数据检索与处理
作者从GEO中获取GBM中外泌体的定量基因表达谱，两套数据集分别为GSE106804（lncRNA / mRNA）和GSE112462（miRNA）。其中GSE106804数据集包含13个GBM血清外泌体样本和6个来自健康供体的正常血清外泌体样本。GSE112462数据集包含10个GBM血清外泌体样本和8个来自健康供体的正常样本。此外，作者从TCGA（lncRNA / mRNA），GSE80338（lncRNA / mRNA），GSE63319（miRNA）和GSE25631（miRNA）中提取了GBM肿瘤组织和正常脑组织中基因表达谱的信息。从TCGA中选择了151名具有完整临床和生存数据的GBM患者构成训练集。验证集来自于CGGA数据库的350名GBM患者。
1.2识别差异表达的RNAs
应用edgeR筛选GBM血清外泌体和正常血清外泌体之间DE-RNA。同样地，作者进一步筛选了GBM肿瘤组织和正常脑组织之间的DE-RNA。最后，对这些差异RNAs取交集得到从GBM外泌体样本和肿瘤样本中最终的DElncRNA，DEmiRNA和DEmRNA。
1.3构建ceRNA网络
使用miRcode数据库预测DElncRNA和DEmiRNA之间的相互作用。从数据库TargetScan，miRTarBase和miRDB中检索被DEmiRNA靶向的DEmRNA。根据先前识别的lncRNA-miRNA和miRNA-mRNA关系对，选择在所有3个数据库中识别的miRNA-mRNA关系对中的mRNA作为构建ceRNA网络的候选基因。应用Cytoscape软件对构建的ceRNA网络进行可视化。
1.4功能和通路富集分析
应用DAVID对ceRNA网络中的mRNA进行GO和KEGG富集分析。
1.5基于exo-lncRNA的预后风险评分模型的构建与评价
作者首先应用单变量COX回归来识别与生存相关的exo-lncRNA，对显著的DElncRNA进一步进行lasso回归分析。最后使用多变量COX回归分析确定了最佳的预后相关exo-lncRNAs，并构建了预测OS的风险评估模型。根据中位风险评分将患者分为高低风险组，并评估两组之间的生存差异。应用C指数和ROC曲线下面积来评估该模型的预测能力和准确性。最后在CGGA的GBM队列中验证了TCGA队列中构建的基于exo-lncRNA的预后模型。
1.6 exo-lncRNA标志与肿瘤免疫微环境的关系
在这一部分，作者评估了GBM的肿瘤免疫微环境（TIME）模式和免疫基因组特征，并进一步分析了TIME与exo-lncRNA标志之间的关联。利用ESTIMATE根据GBM样本的基因表达谱评估肿瘤微环境的整体模式。通过ESTIMATE算法预测肿瘤内基质细胞和免疫细胞的丰度以及肿瘤纯度。通过ssGSEA对He等人引入的31个免疫基因集的富集水平进行量化，然后在高低风险组之间进行比较。
1.7构建和验证列线图
使用TCGA训练集和CGGA验证集数据进行了单因素Cox回归和多元Cox回归分析，以检测GBM患者的临床特征是否与OS显著相关。然后在TCGA队列中选择所有独立的预后因素来构建预后列线图，并通过C指数和AUC定量评估列线图的辨别能力。计算NRI指数来比较exo-lncRNA标志和列线图这两个预后模型在预测OS中的能力。最后，应用CGGA队列数据集从外部验证了预后列线图。
1.8胶质母细胞瘤的预后Oncocers的识别
Oncocers是由ceRNA假说介导的串扰定义的，表示同一miRNAs介导的lncRNAs与mRNAs正相关。基于三个与预后相关的lncRNA和ceRNA网络，应用Pearson相关分析和回归分析来识别GBM的Oncocers。此外，还通过Pearson相关性检验来评估lncRNA在肿瘤和外泌体中的表达丰度。
二．结果展示
2.1胶质母细胞瘤外泌体中差异表达的mRNA，lncRNA和miRNA的识别
在各个数据集中筛选的差异表达的RNAs如图1所示，最终作者从GBM肿瘤样本和血清外泌体中获得了520个DElncRNA，29个DEmiRNA和1175个DEmRNA。
图1.识别差异表达的外泌体相关基因
2.2 ceRNA网络的构建
图2展示了ceRNA网络的构建流程图。
图2.流程图
根据以上方法最终作者整合了45个lncRNA，6个miRNA和38个mRNA构建了ceRNA网络，并使用Cytoscape对其进行可视化（图3）。
2.3 GO和KEGG富集分析
作者应用新形成的ceRNA网络中的38个mRNA进行了GO分析，涉及BP，CC和MF类别。结果显示对于BP类别，DEmRNA显著富集于免疫应答，信号转导，细胞通讯方面。对于CC类中，DEmRNA显著富集于质膜，细胞外和外泌体方面。对于MF类中，DEmRNA显著富集于RNA结合，钙离子结合和转录调控活性方面。此外，KEGG通路分析显示DEmRNA主要富集于VEGF和VEGFR信号网络、CDC42活性的调节和Syndecan-1介导的信号事件中。
图3.ceRNA网络的整合分析
2.4基于exo-lncRNA标志的预后风险评分模型的构建和评估
作者首先对45个候选DElncRNA进行了单变量Cox回归分析，其中28个与OS显著相关。然后应用lasso罚分的Cox回归来选择潜在的与预后相关的6个DElncRNA。最后进行多变量Cox回归分析，确认了3个lncRNA。预后风险评分公式如下：风险评分= HOTAIR的表达水平×0.341 + SOX21-AS1的表达水平×（-1.208）+ STEAP3-AS1的表达水平×0.903。首先计算了TCGA训练集中每位患者的预后评分，根据风险中位数将所有患者分为高低风险。KM生存分析显示高危组的OS显著低于低危组。并且在TCGA训练集中exo-lncRNA标志对0.5年，1年，2年和3年OS率具有良好的预测能力。最后应用CGGA的外部数据集对exo-lncRNA标志进行了验证。结果证实了exo-lncRNA具有良好的预测能力（图4）。
图4. TCGA训练集和CGGA验证集中exo-lncRNA特征的风险评分分析
2.5 exo-lncRNA标志与肿瘤免疫微环境的关系
首先通过ESTIMATE算法评估GBM患者的一般TIME模式，结果表明在两个队列中高危GBM患者的免疫和基质细胞浸润水平更高。相反高危组的肿瘤纯度均较低（图5）。此外，作者通过ssGSEA对代表GBM整体免疫活性的31个免疫特征的富集水平进行了量化。结果显示在TCGA训练集中，高低风险组之间有18个免疫特征存在显著差异，在CGGA验证集中，两组之间有27个免疫特征存在差异，选择了16个共有的免疫特征进行进一步分析。作者还分析了exo-lncRNA特征与16个免疫特征之间的相关性，TCGA队列中有9个免疫特征与exo-lncRNA特征显著相关，CGGA队列中有7个特征显著相关。最后，相交的五个免疫信号包括细胞溶解活性，细胞毒性T淋巴细胞水平，调节性T细胞，检查点分子和T细胞共抑制与基于exo-lncRNA的风险评分显著正相关。
图5. TCGA训练集和CGGA验证集中的exo-lncRNA标志与肿瘤免疫微环境之间的关联
2.6 exo-lncRNA标志的确定作为独立的预后因素
表1显示了来自TCGA训练集和来自CGGA的验证队列中的GBM患者的人口统计学和临床病理学特征。
表1. 基于exo-lncRNA特征的TCGA训练和CGGA验证队列中GBM患者的人口统计学和临床病理学特征
首先进行单变量Cox回归分析，以检测TCGA训练集中exo-lncRNA标志或临床病理因素是否与OS显著相关（表2）。发现exo-lncRNA标志，年龄，药物治疗，放疗，IDH突变状态，MGMT启动子状态和ATRX状态与OS显著相关。然后进行多变量Cox回归分析来识别独立的预后因素（表2），发现由TCGA训练集构建的预后exo-lncRNA标志是GBM的独立预后因素，并在CGGA的外部验证队列中被证实。
表2. 在TCGA GBM训练和CGGA GBM验证队列中，对临床病理变量和exo-lncRNA标志进行单因素和多因素Cox比例风险分析
2.7预后列线图的构建和验证
作者使用六个独立的预后因素构建了预后列线图，使用列线图进行的0.5年，1年，2年和3年生存预测的AUC值分别为0.731、0.897、0.945和0.907，表明具有良好的预测能力（图6）。NRI分析表明，列线图正确重新分类的比例在1年中增加了20.3％，在2年中增加了21.5％。此外，基于CGGA外部验证队列，预测OS的列线图C指数，AUC值均显示CGGA队列中0.5、1和3年OS的预测性能良好。
图6. 列线图预测GBM患者0.5、1和3年生存概率
2.8识别胶质母细胞瘤的预后Oncocers
基于ceRNA网络和三个与预后相关的lncRNA，作者进一步进行了回归分析和Pearson相关检验来识别预后的Oncocers（图7）。总共识别出11对预后Oncocers。miR-338-3p和miR-338-5p参与多个ceRNA途径。此外，回归分析表明，3种与预后相关的lncRNAs在外泌体和肿瘤组织之间的表达丰度一致。
图7. lncRNA和mRNA的相关性分析
2.9三种预后相关的长非编码RNA的表达分析、生存分析和基因集富集分析
分析表明GBM组织或外泌体中HOTAIR，SOX21-AS1和STEAP3-AS1的表达明显高于正常样本（图8）。此外，生存分析证实HOTAIR和STEAP3-AS1的高表达与更差的OS相关，而SOX21-AS1的高表达与更好的OS相关。GSEA分析发现HOTAIR，SOX21-AS1和STEAP3-AS1高表达组主要富集与癌症相关的通路，包括细胞凋亡，ECM受体相互作用，黏着斑，JAK-STAT信号传导途径，细胞周期，钙信号传导途径和MAPK信号传导途径。
图8. 对exo-lncRNA标志中包含的三个lncRNA的进一步分析
好啦~这篇文章的内容就这么多啦~总之，外泌体lncRNAs可以作为有希望的预后指标和治疗靶标。基于exo-lncRNA标志的预后列线图对个体化生存预测具有一定的指导意义，并有助于更好的治疗策略。
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