2021/03/02
RNA Sequencing in B-Cell Lymphomas
高通量mRNA测序（RNA-seq）提供了转录组的定性和定量评估。利用互补的 cDNA 产生数以百万计的短reads，与参考基因组对齐，对转录本进行全面的表征。
一、Illumina NextSeq or MiSeq platforms执行mRNA测序的协议
二、测序数据质量指标
1、样本质量控制
2、文库质量控制
准确地量化cDNA文库：qPCR
3、RNA-Seq数据质量控制与评估（Illumina software tools）
三、用于序列对齐的生物信息学管道
1、直接比对到参考基因组或转录本
挑战：跨越内含子-外显子边界的reads（a major challenge is the alignment of RNA-Seq reads that span across intron-exon boundaries）
Tool：STAR2, a gapped aligner, 可以有效的分割在内含子-外显子交界处的reads ----> Bam文件 （Integrated Genomics Viewer (IGV) 可视化）
2、重新组装随后比对
四、数字基因表达
Digital gene expression (DGE) analysis：（特别是表达水平高/低的转录本）提供了更广泛的动态范围，提供了更好的分辨率，增强了fold change（差异倍数，由FPKM估计） 的测定。
1、规范给定研究中的样本集，使数据相互比较（to effectively normalize the sample set within a given study to make the data cross-comparable）
FPKM（避免了paired-end reads的冗余计数）/ RPKM
HTseq-count package：可直接用于 STAR2 BAM file 的 FPKM 计算
DESeq2：估计 dispersion and fold change -----> 不同表达基因的基因列表 ---->（pathway enrichment analysis / gene ontology analysis）: GSEA tool
2、进一步分析DGE表达谱（ by Cluster software），可视化 ---- > 制作热图（ by TreeView）
五、基因融合的检测（fusion gene）
检测方法：检测来自基因组两个不同位置的序列组成的嵌合reads或者reads pairs的融合事件
artifacts（阴影）：太短不能比对到基因组（位置不唯一），比对到重复区域，映射到基因组同源性较高的区域，文库准备时出现的缺陷。
Tool：FusionCatcher is a gene fusion detection software that utilizes FASTQ files to produce gene fusion models including an assembled junction gene.
感兴趣融合基因的重点分析：BLAST search 手动确认已识别的融合事件
六、可变剪接发现和可视化（IGV）
alternative splicing (AS)两个可分析的子类：已知转录异构体差异基因的表达，检测新的转录本和已知亚型的结构畸变。因为区分多个转录本共有的reads的困难，以及使用短reads检测large structural alterations的能力的限制，使得AS的数据挖掘成为一个很大的挑战。
Tool： Cufflinks，利用FASTQ 文件产生FPKM基于异构体水平和转录本结构的研究结果，作为一般特征格式(GTF)文件（as a general feature format (GTF) file）。
七、遗传变异的描述和注释
Schematic workflflow of RNA-Seq pipeline
RNA-seq方法导致的假阳性（false positives）水平更高。
癌症生物学的重点在于具有激活或灭活基因功能潜能的非SNP突变的确定。根据基因组坐标确定与SNP相对应的SNV，使用注释数据库（ANNOVAR or SnpEff）注释非同义SNV。
八、新免疫球蛋白基因装配
大多数B细胞非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphomas，NHL)表达B细胞受体(B-cell receptor，BCR)，BCR是由两个相同的重链和两个相同的轻链免疫球蛋白(Ig)多肽组成的膜结合抗体，非共价地与信号元件CD79A和CD79B相结合。免疫球蛋白由可变(V)区和恒定(C)区组成，重链V区由三个(V、D和J)基因片段组成，而轻链由两个基因片段(V和J)组成)。在B细胞的发育过程中，这些基因片段通过体细胞DNA重组被组装来编码一个有功能的Ig。Ig基因片段装配产生非种系编码的免疫球蛋白分子，在大多数的成熟B细胞中强烈表达。大多数B细胞NHL表达独特的Ig重链和Ig轻链分子，允许在80%-90%的NHL中重新组装、映射和注释这些转录本。
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