基于pheS*负筛选标记的细菌无痕编辑

阅读文献可以拓宽学术视野，而深挖复刻文献数据，有助于实验开展的更加顺利。知是行之始，行是知之成，“知行合一”，方能游刃有余。
有感于此，正式开启本人的“文献掘坟”之旅！

今天来挖2017年发表在Appl Microbiol Biotechnol上的一篇文章
pheS (*) , an effective host-genotype-independent counter-selectable marker for marker-free chromosome deletion in Bacillus amyloliquefaciens.

文献思路

利用pheS作为负筛选标记构建PC模块，将PC模块转化进入细胞，经过双交换重组就可以将筛选标记插入基因组，同时引入需要的突变。之后，借助于DR序列之间的重组，通过负筛选标记的致死效果，就可以筛选到抗性标记消除的菌株。

原理概览

优点

无痕编辑，不会残留抗性基因、scar序列等；
在野生型宿主中的广泛适用性， 无需对基因组进行任何预突变；只需PC盒与重叠延伸PCR， 整个过程可在３ 天内完成， 适用于基因敲除、基因插入和定点突变， 成功
率为100％ 。

材料篇：

E. coli-Bacillus shuttle vectorpNW33N，淼灵生物有现货质粒
Temperature-sensitive E. coli-Bacillus shuttle vector pNZT1
序列从专利中挖掘出来：一种地衣芽孢杆菌的基因编辑方法及应用
pMD19-T
其他基因组序列从NCBI下载
培养基：
LB培养基：peptide （10）、酵母提取物（5）和氯化钠（5）组成。
MGY培养基：葡萄糖（5）、酵母提取物（4）、NH4NO3、NaCl (0.5), K2HPO4
(1.5), KH2PO4 (0.5)和MgSO4 (0.2)。
MGY-Cl培养基是补充有5 mM p-Cl-Phe(Sigma, lot no. SHBC0245V)的基于MGY的培养基，其在115℃高压灭菌前加入到培养基中。通过向液体培养基中加入15 g/L琼脂获得固体培养基。

实验步骤

1. 负筛选标记元件构建

1.1 扩增pheS gene及点突变
下载B. subtilis 168基因组序列，通过IGV软件找到pheS基因，然后用文章列出的引物进行扩增模拟。
命名为：1.1 pheS gene of B. subtilis 168 as a template

pheS gene

1.2 启动子strong promoter Pbc
从作者给出的连接中下载完整序列http://parts.igem.org/Part:BBa_K090504
引物模拟扩增。
命名为：1.2 BBa_K090504 strong promoter Pbc

Pbc promoter sequence
atttttaaagtatgtatacaaatgatgaataaattttggcgatataatgaaggatacagctcccataattggtaaagatactagatagattcatcgtaaaatcatgattttgccaaatttgcccttgaatattagtagcgttttctttacaatcgtaaatagtgtaaaaaagcgtgcaaacgcatgaatatcatctaaaggagagattcacatgggaaaactgtatgtatttgatcctc

1.3 抗性基因cat扩增
以plasmid pNW33N为模板，引物模拟扩增。
命名为：1.3 pNW33N（淼灵生物）

cat gene

1.4 Pbc-pheS※-cat (PC) cassette
利用snapgene模拟重叠延申PCR，得到重组片段；
命名为：1.4 Pbc-pheS-cat

PC cassette
然后克隆至载体pMD19-T，命名为：
1.5 pMD19-T-Pbc-pheS-cat
注意，这里出现了问题，文章给出的引物9aPC-F并不能找到结合位点

2. 删除amyE基因

2.1 amyE基因下载
从NCBI下载Bacillus velezensis SQR9基因组序列，找到amyE基因，并用指定的引物划分选择区域。
命名为：2.1 amyE gene in B. amyloliquefaciens strain SQR9

LF是amyE基因上游的771bp片段；
RF是amyE基因编码区的818bp片段（ATG开始）；
DR是amyE基因终止密码子下游的513bp序列；

amyE基因

2.2 敲除模块的片段融合
利用snapgene 软件重叠延伸4各片段，操作如下图：

image.png

命名为：2.2 amyE(LF-DF-PC-RF).dna

image.png

2.3 插入染色体
直接将融合的PCR产物导入到菌株感受态当中
The resulting 4.0-kb amyE deletion amplicon (PCR product) was directly transformed into strain SQR9, and the transformants were selected on LB plates containing Cm.

接下来发生的，就都知道了
1.染色体上的LF和RF与PCR产物的LF和RF发生双重组；

2. 整合后的染色体上的DR之间发生重组；

   
   image.png

双交换插入后的PC cassette刚好位于amyE基因上游。
因为插入的DR与amyE基因的DR同时存在，会导致细菌染色体重组概率的发生，一旦重组就会丢失掉PC cassette。所以，可以通过添加p-Cl-phe进行负筛选，DR之间发生重组，可以完完整整的剔除掉amyE基因。无痕、丝滑！！！

3.1 PC元件加酶切位点
按照引物模拟扩增含酶切位点的片段（没有扩增抗性基因cat）
命名为：3.1 酶切位点扩增Pbc-pheS-cat
Construction of the vector pNZT1-pheS

image.png

3.2 温敏载体构建
以载体pNZT1为骨架，模拟酶切连接，构成新的载体
命名为：3.2 pNZT1-pheS.dna

image.png

不能说太像，只能说一模一样。

image.png

后续如果应用这个载体进行基因编辑，则还是需要扩增LF、DF、RF等，融合形成LF-DF-PC-RF

应用技术时候需要注意：

1. 测试野生型宿主细胞对p-Cl-phe是否具有抗性；
2. 携带突变的宿主细胞必须对p-Cl-phe敏感， 从而实现有效的反向筛选。

类似的文献：

1. Counterselection employing mutated pheS for markerless genetic deletion in Bacteroides species