Sweeping antibody 学习

Chugai 公司 2022 年发表的《通过pH依赖的抗原结合及新 Fc 工程方法清除食蟹猴血清中的可溶性抗原》文章，学习一下。针对循环中的可溶性抗原，通常需要大剂量高频率的静脉注射去中和抗原。这是因为 antigen 的降解是以抗原-抗体免疫复合物的形式，它可以利用 FcRn 介导的循环，逃避溶酶体的降解。Sweeping antibody 可以通过增加细胞免疫复合物的摄取，并在酸性内体中与抗原解离，有效清除血清抗原。强力的 antigen sweeping 可以减少药物剂量，扩展抗体的空间作用范围。

在这项研究中，为了提高 sweeping 效率，文章开发了一种新的 Fc 突变体，提高了与 FcγRIIb 的结合，调节电荷性质增加细胞对免疫复合物的摄取，并且增强与 FcRn 的结合来有效地挽救 antigen-free 抗体。文章开发的 Fc 突变体在食蟹猴中获得了很强抗原清除效率，其抗体药代动力学与野生型人 IgG1 抗体相当。

在体外实验中，正电荷替换增强了表达 FcγRIIb 细胞对免疫复合物的摄取，这种摄取被 anti-FcγRIIb 抗体完全抑制。这表明 强抗原清除 主要是依赖电荷替换后 FcγRIIb 对抗原复合物摄取实现的，而不是非特异性摄取实现。文章期望新的 Fc 工程可以最大限度地提高抗原清除效果，并创造新的治疗抗体。

1 引言

可溶性抗原被细胞摄取后，酸性内体中的 free antigens 可以被运输到溶酶体进行降解，但是抗原-抗体免疫复合物可以利用 FcRn 介导的循环，再次释放到血液循环中。 近些年新开发的 pH-dependent 抗体可以在酸性 pH 下与抗原弱结合，pH 中性下强结合，在酸性内体中与抗原解离，可以达到很好的抗原清除的目的。细胞膜上的负电荷和抗体上的正电荷相互作用，可以增加免疫复合物的摄取。但是，抗体上的正电荷也会增加抗体的清除，因此需要综合考虑。Fc variant 采用的功能组合 : FcγRIIb binding increase + Charge engineering + FcRn binding increase + Fab pH sensitive

2结果

2.1 设计强 sweeping antibody

1、 NpH-IgG1 为非 pH sensitive 抗体，pH-IgG1 为 pH sensitive 抗体。表 1 中列出了 SPR 测定的与 myostatin 在不同 pH 下的亲和力；

2.2 特异性增强结合 FcγRIIb 突变筛选

1、之前研究发现增强与 FcγRIIb 的结合，可以增强可溶性抗原的清除。因此需要筛选特异性增强结合 FcγRIIb 突变，而且为了保证不引起有害的免疫激活，同时要求与其他激活型 FcγRs 弱结合；
2、表 2 中V3组合的突变效果最好，Fc 与人源和猴的 FcγRIIb binding 与 WT 相比，分别增强了 3.06 倍和 2.86 倍；

2.3 正电荷替换引起细胞摄取免疫复合物效应增强及抗体药物动力学

1、之前研究发现Fc电荷替换可以减少 antigen 的聚集。在 pH-dependent IgG1 上进行了 pI(A), pI(B), pI(C) 组合突变，这些突变没有影响 Fc 与 FcγRs 的结合，如表2所示；
2、通过体外胞吞实验，验证了pI(A), pI(B), pI(C) 突变体的胞吞效果，如Fig2A; 也测定了血清中抗体清除的动力学， pI(A)的影响较小，如Fig2B；

2.4 增强结合 FcγRIIb 突变和正电荷替换突变在小鼠体内对可溶性抗原清除的影响

1、pH-V3-pI(A) 、V3-N434A 、V3-pI(A)-N434A 与Fc receptor 的结合参数如表2所示；
2、myostain 的清除效率如Fig3a 所示，pH-V3（增强结合 FcγRIIb 突变）增强了清除率，pH-V3-pI(A)（增强结合 FcγRIIb 突变和正电荷替换突）清除率更高；

2.5 Fc engineering 对食蟹猴中内源性抗原浓度的影响

1、添加 N434A 突变至pH-V3、pH-V3-pI(A) 上，期望增加与 FcRn 的 binding , 获得更长的半衰期延长效果；
2、 如图Fig4a 所示，血清中总 myostatin 浓度，NpH-IgG1 组最高，依次为 pH-IgG1、pH-V3-N434A、Vehicle、pH-V3-pI(A)-N434A; pH-V3-pI(A)-N434A 效果最好，抗原总浓度在基线以下；
3、如图Fig4b 所示，抗体的清除率影响不明显；

2.6 Fc engineering 改造 FcγRIIb 介导的胞吞作用增强

1、血清中抗原抗体复合物的清除主要依靠 肝窦内皮细胞 和 库普弗细胞 ,它们都表达 FcγRIIb；
2、为了验证电荷替换对体内 antigen sweeping 的影响，使用表达/不表达 huFcγRIIb 的CHO细胞系进行验证；含有 pH-V3-pI(A) 突变组合的组结合和内吞最强，含有 anti-huFcγRIIb 抗体（2B6）组被完全抑制；这表明正电荷替换可以增强 FcγRIIb 结合和 FcγRIIb 介导的特异性胞吞，而不是非特异性胞吞。

3 讨论

1、由于质膜是带负电荷，细胞膜上的负电荷和抗体上的正电荷相互作用，可以增加免疫复合物的胞吞作用；
2、前期工作已经验证了Fc engineering的突变不会影响抗体的热稳定性和聚集等特性，但是会影响C1q的作用，因为FcγRIIb 和 C1q的作用区域重合；

4 参考文献

[1] Hori Y, Ohmine K, Katada H, Noguchi Y, Sato K, Nambu T, Adeline LR, Wan GS, Haraya K, Ozeki K, Nanami M, Tachibana T, Sampei Z, Kuramochi T, Nezu J, Hattori K, Igawa T. Elimination of plasma soluble antigen in cynomolgus monkeys by combining pH-dependent antigen binding and novel Fc engineering. MAbs. 2022 Jan-Dec;14(1):2068213. doi: 10.1080/19420862.2022.2068213. PMID: 35482905; PMCID: PMC9067469.