双硫仑在格雷夫斯眼眶病的体外模型中发挥抗脂肪生成、抗炎和抗纤维化的治疗作用
采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blotting检测关键成脂转录因子ALDH2A1、ALDH1和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号蛋白的表达。
周脂蛋白-4（PLIN1）、PPARγ（PPARG）、FABP1和c/EBPα（CEBPA）等关键成脂转录因子的表达下调。
我们假设双硫仑 （DSF） 是一种用于治疗酒精中毒的醛脱氢酶 （ALDH） 抑制剂，对 GO 中的眼眶成纤维细胞 （OF） 具有治疗作用。DSF 可减弱 HA 的产生并抑制炎症分子表达。
我们测量了与纤维化相关的标志物的 mRNA表达。用 10 ng/mL TGF-β1 处理 48 小时的细胞表现出 ACTA2、FN1、COL1A1、COL1A2 和 TIMP1 的增加。此外，与DSF的共处理显着降低了这些标志物的水平。
香豆素在脂肪生成衰减过程中调节 Akt 和 Wnt/β-catenin 信号转导
这些结果表明，香豆素通过调节Akt和Wnt/β-catenin信号传导来抑制脂肪细胞分化，并可能具有作为防止脂肪生成的药物的潜力。
透明质酸在人类脂肪生成中的作用：来自体外和体内研究的证据
我们之前的数据表明，在人类脂肪生成过程中，HA的产生减少，表明了抑制作用。与对照组相比，4-MU对HA的抑制显著增强了脂肪生成培养基 （ADM）诱导的脂肪生成，增加了1.52±0.18-（ORO），增加了4.09±0.63-（病灶）和2.6±0.21（标志物）倍，还增加了PPARγ蛋白表达（40%，（p < 0.04））。
敲低HAS1和HAS2后，PPARγ转录物水平分别显著降低48%或增加16%（图1A）。我们之前的研究显示，敲低HAS1亚型可能导致HAS2转录物和HA产生的代偿性增加。
作为替代方案，我们产生稳定表达HAS1或HAS2的HEK293细胞系作为HA特异性富含异构体的上清液的来源（HA与对照细胞相比增加10-20倍）。在无血清培养基中，用HAS2-HEK293富含HA的上清液处理非修饰的皮下PFs显示PPARγ转录本显著减少30%；与HAS1-HEK293或用空载体转染的对照HEK293细胞没有观察到差异（图1B）。这些数据表明产生的HA有助于PPARγ表达的负调控，并可能在脂肪生成中发挥抑制作用。
抑制HA生成促进脂肪生成
为了研究HA在调节皮下PFs脂肪生成中的可能作用，我们使用不同浓度的HA生物合成抑制剂4-methylumbelliferone（4-MU）结合成脂鸡尾酒进行了进一步的实验。4-MU处理如预期的那样显著降低了细胞培养上清液中的HA（数据未显示）。初步实验显示诱导的脂肪生成concentration-dependent增加，0.1mM 4-MU最适合分化
Low-Molecular-Weight HA对脂肪生成有抑制作用
研究HA在细胞发育中的作用的各种研究发现，HA对许多细胞过程的影响依赖于分子量。因此，在成脂培养基中用不同分子量的HA培养皮下PFs。用41-65 kDa LMW-HA治疗PFs导致脂肪生成的抑制，LPL表达显著减少。 相比之下，high-molecular-weight（HMW）-HA亚型（151-300 kDa和1.01-1.8 MDa）对脂肪生成没有影响。
讨论部分
HA位于细胞外，需要形成成熟脂肪细胞发育的结构;越来越多的证据表明，HA与脂肪生成之间有很强的相关性[4]。我们目前的研究表明，HAS2产生的HA在调节脂肪生成的关键转录因子PPARγ中起抑制作用[18]，我们使用siRNA敲低或暴露于富含HA的上清液的实验证明了这一点。其他研究也表明，尽管使用细胞系，PPARγ在HA调节脂肪生成中发挥重要作用[15,16]。HA可能与其受体CD44相互作用，触发IGF1信号传导[24]，这是通过PPARγ调节促脂肪所必需的[2,25]。此外，使用4-MU化学抑制HA的产生显著增强了脂肪生成，并伴随着PPARγ表达的增加，特别是脂肪特异性亚型PPARγ2[22]。通过HAS的不同亚型在干细胞中发挥HA功能的详细机制在很大程度上仍然未知。我们目前的研究表明，先前报道的通过皮下脂肪生成减少的HAS2转录本和HA的产生[19]可能通过PPARγ2调节进一步支持脂肪生成。
研究表明，HA和脂肪生成在肥胖、糖尿病和炎症中起着重要作用，并指出LMW-HA（<120 kDa）具有负面影响[4,7,8,13]。例如，LMW-HA片段有助于促炎细胞因子的释放[26]，或HA片段通过与其受体相互作用对脂肪生成的影响[27]。在目前的研究中，过表达HAS1和HAS2的原代人PF显示出增殖受损（数据未显示），支持HA在干细胞功能中的重要性[28]。此外，我们的研究提供了证据，证明 41-65 kDa 片段的 LMW-HA 可以抑制人皮下 PF 中的脂肪生成，但不能抑制 151-300 kDa 和 1.01-1.8 MDa 的 HMW-HA 片段。需要注意的是，这些 LMW-HA 片段 （41–65 kDa） 是由 HAS2 产生的 HMW-HA 产生的，其超过 2 × 106达[27]。需要进一步的研究来阐明抑制脂肪生成所需的 HAS2 产生的 HA 代谢机制。
总之，我们已经证实了 HA 在人类脂肪生成中的抑制作用，并建立了血容量调整后的 HA 浓度与 BMI 和甘油三酯水平呈负相关。这可能反映了 HA 产量降低与脂肪组织数量增加的关联。这一观察结果与我们之前关于人皮下脂肪生成中HA产生减少的发现一致[19]。此外，我们目前的研究中显示，通过抑制 HA 增强体外脂肪生成表明，自然减少的 HA 产生可能作为脂肪生成的促进剂。
透明质酸在脂肪生成、脂肪组织生理学和全身代谢中的应用 **杂志Matrix Biol
背景
透明质酸（Hyaluronan， HA）是一种非硫酸化的线性糖胺聚糖聚合物，由β-1,4连接的重复双糖单元d-葡萄糖醛酸（GlcUA）和β-1,3连接的N-乙酰-d-氨基葡萄糖（GlcNAc）组成。HA分泌到大多数哺乳动物组织的细胞外基质中，由三种质膜结合的透明质酸合成酶HAS1、HAS2和HAS3合成。在它们的合成过程中，新生的HA链通过孔隙状结构挤出到细胞外空间[1]。新合成的HA可以被透明质酸酶（hyaluronidase，HYALs）加工，也可以被活性氧非酶解分解[2]。透明质酸酶水解HA链GlcNAc和GlcUA之间的己糖胺β（1-4）连接，释放小的HA片段
HA在不同器官中的半衰期不同[3，4]。HA在循环中的周转极快。在人体中，HA的血浆半衰期估计约为2-6分钟，总周转量为10-100mg/d[5]，各种组织中的全身HA周转估计在3天内发生，每天周转约5g[6]。在细胞水平上，HA的合成和降解也非常动态。在细胞中，正常的HA合成被短暂激活以进行细胞分裂或运动，之后HA通过内吞吸收和hyaluronidase-catalyzed水解迅速从部位清除[7]。
透明质酸溶液的物理性质，可以影响脂肪组织的状态**
不同组织中HA的浓度差异显著，人体皮肤中HA浓度最高可达500μg/g，妊娠晚期宫颈中HA浓度最高可达5mg/g，滑液中HA浓度最高可达3mg/mL，血清中HA浓度最高可达100ng/mL[18，19]。在肥大脂肪组织中，HA浓度最高可达16pg/细胞[20]，对于直径约100μm的细胞，其体积浓度约为30μg/g。由于脂肪组织中HA主要集中在脂肪细胞周围的细胞周空间，因此肥大脂肪细胞周围HA的局部浓度可能要高得多。
HA的相对浓度对HA溶液的生物物理特性至关重要，因为HA分子表现为高度水合的随机线圈，在浓度约为1mg/mL时开始缠结[21]。在缠结点以上，HA溶液的粘度随着HA浓度c的增加而迅速增加（呈指数级，如c3.3），HA溶液变成凝胶状。这种行为会显著影响脂肪组织干细胞（ASCs）的增殖和分化特性[22]。HA凝胶的弹性也随着HA分子量和浓度的增加而增加。
HA凝胶中的渗透压取决于溶液的浓度和离子强度，J，如π=Ac9/4J−3/4，其中A约为1.4×103kPa，c和J以摩尔表示[23]。这一行为对应于先前报道的实验结果，即浓度为5 mg/mL、10 mg/mL和20 mg/mL的HA溶液的渗透压分别约为1 mm Hg、4.5 mm Hg和18 mm Hg[24]。如果HA与胶原连接，则渗透压会进一步增加，这在WAT中是如此，细胞周HA与Col VI连接。由于与对照组相比，饮食诱导和遗传肥胖的小鼠在WAT中的HA浓度会增加两倍以上[20]，这种现象会导致凝胶中的渗透压增加约4.75倍。渗透压的增加会强烈减少WAT中的经毛细血管转运，从而产生类似于实体肿瘤中观察到的条件[25]。如果溶液含有高离子强度的盐，HA凝胶中的渗透压可以降低[23]。例如，在含有100mM NaCl+100mM CaCl2的溶液中，HA凝胶中的渗透压将比含有200mM NaCl的溶液降低3.5倍。最近的一份报告表明，分化的前脂肪细胞（已知在分化期间产生高水平的HA）在更高浓度的NaCl存在下显示脂肪沉积减少[26]。
一旦细胞经历了外部渗透压的增加，水就会流出细胞，其体积和膨胀就会减少，细胞就会收缩，直到达到新的渗透平衡。这可能会对细胞造成重大损害。为了对抗这种损害，不同类型的细胞会迅速产生和积累多元醇，就脂肪细胞而言，多元醇以甘油的形式存在。 如果甘油通过水甘油孔通道运输，细胞内积累的甘油会从细胞中泄漏出来，除非这些通道被有效地灭活。如果这个过程持续下去，脂肪细胞将需要持续合成甘油或进行脂肪分解。脂肪细胞持续流出的甘油会进入循环，最终进入肝脏和其他器官。这可能是身体轮廓的潜在机制。例如，在身体轮廓处理过程中，额外的脂肪组织HA会在高温下产生。HA与大量水分结合，暂时改善局部皮肤纹理，同时促进脂肪组织脂肪分解；随后，过度积累的水分和输出的甘油和脂质将随着时间的推移被清除，从而导致圆周减少效应。
透明质酸在脂肪生成
白色脂肪细胞组织在发育过程中通过细胞增生和体积扩张以及卡路里过剩而生长。然而，白色脂肪细胞的起源和发育过程（尤其是成年期）很复杂，仍有待完全了解，尽管最近取得了很大进展[27]。普遍的假设是，血管周围细胞群中Pdgfrβ和Zfp423含量高，类似于壁细胞（周细胞和血管平滑肌细胞），在促成脂条件下产生新的脂肪细胞，例如高脂肪饮食治疗[28]。在前脂肪细胞成熟过程中，它们逐渐改变形状并积聚脂滴，这一过程需要与细胞外基质的重塑相协调，以适应不断扩大的细胞体积和细胞间隙[29]。反之亦然，脂肪生成在空间和时间上都受到ECM的调节。
在体外3T3-L1前脂肪细胞分化过程中观察到HA水平的变化[30]，高血糖甚至可以将分裂的成骨前体细胞转移到代谢应激的成脂程序，同时诱导透明质酸的合成[34]。在培养基中补充HA延长寿命，减少细胞衰老，增强小鼠脂肪组织基质细胞的分化潜力[31]。相比之下，3T3-L1细胞的脂肪生成受到抑制，通过外源性透明质酸酶处理它们，或通过抑制HA合成，通过4-methylumbelliferone处理或通过降低HAS2水平[32]。值得注意的是，大多数脂肪细胞在高糖和高胰岛素条件下培养，以促进分化并保持其脂肪细胞身份[3033体外体内体内给予外源性透明质酸酶减少腹部脂肪积累并抑制肝脏中的脂质积累，从而增加胰岛素敏感性[32，35]，暗示HA可能在体内脂肪生成中发挥作用。
HA通过与不同细胞表面蛋白结合，对脂肪组织发挥多种不同的生物学功能，包括CD44、RHAMM/HMMR、Brevican、TNFIP6、LYVE1和SHAP等受体[36-38]。CD44是HA的主要细胞表面结合蛋白之一[39]，前脂肪细胞中的 PDGFRɑ + CD44+ 亚群具有高度增殖性[40]。激活RHAMM/HMMR受体拮抗CD44信号传导，抑制脂肪生成[41]。HA的成脂潜力及其物理特性使其成为前脂肪细胞preadipocytes或脂肪细胞干细胞adipocyte stem cells（ASCs）体内移植的首选支持基质[42-46]。一项研究评估了人类ASC同种异体移植的不同支架，结果显示，当细胞被包裹在交联透明质酸支架凝胶中时，hASCs的分化增强[47]。在猪身上进行的类似实验显示，成熟脂肪细胞的胰岛出现，以及注射的前脂肪细胞与HA凝胶混合产生的脂肪组织新生血管；有趣的是，羧基酰胺化的交联程度似乎是决定HA凝胶成脂潜力的一个重要因素[46]。在兔模型中，HA支架还显示出减少同种异体移植期间脂肪细胞的坏死[48]。
HA也用于体内“米色”或“brite”脂肪细胞的分化，这是与棕色脂肪细胞相似的第三种脂肪细胞，富含线粒体和解偶联蛋白-1（UCP1）[49，50]。米色脂肪细胞可以通过transdifferentiation从交感神经信号[51-53]控制的白色脂肪细胞中出现，或者通过54，55]。UCP1阳性米色脂肪细胞的扩增将线粒体呼吸与ATP合成分离，已多次被证明通过降低循环葡萄糖和脂质水平在生理上有益。然而，在成人中，棕色或米色脂肪组织很少，冷诱导仍然是迄今为止诱导米色脂肪组织的最有效方法。因此，重要的是设计大量UCP1阳性米色脂肪细胞从头米色脂肪生成，也介导交感神经输入[在体内。配制透明质酸支架的最新进展使功能性组织同种异体移植成为可能[56]，支持移植的ASC在体内分化为米色脂肪组织，并在宿主体内成功血管化[57]。
尽管在体外或动物模型中有许多积极的结果，但HA的促脂作用在一些研究中受到质疑[58]。上述研究面临的挑战是回到确切的注射部位解剖移植组织进行组织学分析。许多时候，组织学图片无法确定脂肪细胞与基质中的其他类型细胞的区别，特别是在装载脂质滴和真正脂肪细胞的细胞中。
重要的是，HA的代谢结果也是其大小的函数[38]，与脂肪组织上的高分子量HA相比，低分子量HA片段具有非常不同的功能。透明质酸酶产生的小HA片段可以诱导血管生成，这是脂肪组织健康扩张的重要组成部分。然而，最近的一项研究显示，中等分子量（约50 kDa）HA抑制培养的3个T3-L1细胞中的脂肪生成[76]，使关于不同分子量HA在脂肪生成中作用的观点复杂化。在同一研究组的另一份报告中，50 kDa HA片段已被证明在体外和体内减少成脂分化。.口服这些HA片段可降低高脂饮食小鼠的体重、脂肪组织、血脂（低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯）和瘦素水平。HA片段还可降低脂肪组织的肥大，改善肝脏脂肪变性，显示出强烈的抗肥胖和抗糖尿病作用，可能是通过增强PPARα和抑制PPARγ表达[77]。值得注意的是，口服的HA可能不会进入循环，因此本研究中使用的HA的作用部位可能是肠道消化道。
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