说明书背后的基本原理
对于初步接触分子生物实验的同学，给出几点建议：
- 首先是跟着实验室的师兄师姐学习经验，经验往往是数次实验成功或失败的经验总结。
- 认真研读产品说明书，这是一手资料，隐藏有许多不为师兄师姐口述的诸多细节。
- 在经验和说明书之上，要加强对生物学实验原理的参悟。
举例1：
采用Promega的T7 RNAi试剂盒合成sgRNA为例：
| DNA | 1000ng |
|---|---|
| 2 x Reaction Buffer | 10ul |
| T7 Mix | 2ul |
| H2O | up to 20ul |
这是试剂盒给出的反应体系。要知道，在普通实验中，RNA长度在200-800bp之间，试剂盒给出的体系是确保所有的转录体系能够产生足够量的ssRNA。
但是对于sgRNA来说，长度<200bp，只需要加入1ul T7 Mix足够。
一般的，20ul体系，2ul T7 Mix反应，最后用40ulRNase free water溶解，产物浓度在2500-4000ng/ul之间（总产量为100000-160000ng）。而使用1ul T7 Mix，用35ul RNase free water溶解最后测得的浓度在2000-3000ng/ul之间（为总产量70000-105000ng），增加酶量并未成倍提高产量，加之在下游实验中，所使用的sgRNA剂量非常少，所以用1ul酶足够用。对于这样一个3400元/50次的试剂盒，酶用量减半则可以使用100次。在对于500bp以上片段，由于产物消耗NTP底物，所以建议采用2ul标准体系更为适合。
综合来说，采用剂量的多少，需要结合自己试验的实际需求，如产物长短等适当调整，不是省钱那么简单，更是读懂背后所隐藏的生物学基本原理。
举例2：
microRNA茎环法反转录试验
| total RNA | 1000ng |
|---|---|
| stemloop primer | 10-50pmol |
| dNTP | 1ul |
| H2O | up to 10ul |
65℃ 孵育5分钟，然后冰上冷却5分钟；
| 4X Buffer | 5ul |
|---|---|
| RNA inhibitor | 0.5ul |
| RTase | 1ul |
| H2O | up to 20ul |
在我之前的实验都是跟着师兄学习，采用的是TAKARA的PrimerScript RTase反转录酶，1200元/50次，每次用量又特别大，后来把酶用量改0.5ul后，依然解决不了用量大的需求。后来从生物公司的推荐下买实用了MMLV 反转录酶，同样效果不减。于是思考，miRNA长度不过22nt，采用茎环引物不过60bp，反转录长度120bp以内，常规反转录酶足以胜任如此短片段的反转录，但是实验室一直传承采用了TAKARA的这款高质量长片段反转录酶，着实大材小用，采用普通的MMLV反转酶，价格为之前的1/4。如果不去思考背后的分子生物学原理，那只能是在烧钱的路上走的愈发久远，还要承受老板无情的谩骂。
举例3：
昆虫DNA提取，实验室采购的是OMEGA试剂盒，2200元/200次，而用法无非是裂解液裂解，然后加蛋白酶K处理，苯酚氯仿抽提后，加入异丙醇的混合试剂析出核酸最后过柱纯化。
而我自己配置的试剂，操作上类似RNA Trizol提取步骤，不需要使用氯仿等有机溶剂抽提，最后采用单独购买的普通核酸纯化柱，所得产量与OMEGA比有过之而无不及，成本确是实验室最基本的试剂而已。
所以，读懂核酸提取的基本操作背后的原理，蛋白消化释放出核酸，然后有机溶剂夺取溶剂水分子析出核酸，再过柱纯化，仅此而已，还哪里用得上那些贵的离谱的试剂盒呢。
结束语：
如果只想掌握实验基本操作，完全按照说明书或实验经验来做，基本无大碍；
如果想要在实验成功的基础上，读懂更多的信息，明白更多的原理，出现问题之后懂得从哪一步进行深入的分析，以及后面的优化操作，那么，多思考多总结，更能启发你新的思路，对新的实验进行改进创新。
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