Multiplexed, single-molecule, epigenetic analysis of plasma-isolated nucleosomes for cancer diagnostics
Multiplexed, single-molecule, epigenetic analysis of plasma-isolated nucleosomes for cancer diagnostics | Nature Biotechnology
血浆中无细胞 DNA (cfDNA)的分析提供了机体病理过程的信息。血液 cfDNA 以核小体的形式存在，核小体维持着其组织和癌症特异性的表观遗传状态。我们开发了一种单分子多参数分析方法来全面描述血浆分离核小体(EPINUC)、 DNA 甲基化和癌症特异性蛋白质生物标志物的表观遗传学。我们的系统允许通过单分子成像在数百万个单个核小体上高分辨率检测六种活性和抑制性组蛋白修饰及其比率和组合模式。此外，我们的系统提供了敏感和定量的血浆蛋白数据，包括检测非分泌肿瘤特异性蛋白，如突变 p53。EPINUC 分析了63个大肠癌、10个胰腺癌和33个健康血浆样本，即使在早期阶段，也能以高准确度和灵敏度检测出癌症。最后，将 EPINUC 与直接单分子 DNA 测序相结合，揭示了结直肠癌、胰腺癌、肺癌和乳腺癌的起源组织。EPINUC 提供了来自有限(< 1毫升)液体活检材料的潜在临床相关性的多层次信息。
基于无细胞 DNA (cfDNA)分析的非侵入性液体活检方法提供了新一代诊断方法。在健康人血浆和血清中循环的 cfDNA 主要来源于正常血细胞的死亡。然而，在患有癌症的个体中，一部分 cfDNA 是肿瘤衍生的，称为循环肿瘤 DNA (ctDNA)。基于 ctDNA 的序列分析已被证明能够揭示肿瘤特异性的基因改变，并为肿瘤的非侵入性分子分析提供了一种手段。尽管有令人鼓舞的数据，这些方法是有限的，因为它们需要遗传差异(即突变)来区分正常和肿瘤 DNA。基于非遗传特征分析的液体活检方法最近已经出现，最显着的方法是使用组织和癌症特异性 DNA 甲基化和 cfDNA的差异碎片模式。
血浆中的 cfDNA 主要以核小体(cfNucleosomes)的形式出现，核小体是染色质的基本单位，由包裹在核心组蛋白八聚体周围的~150个碱基对(bp)的 DNA 组成。组蛋白通过各种化学基团的共价附着被广泛修饰，形成每个组织独特的组合表观遗传模式，并提供关于细胞内基因表达和调控元件的信息。有证据表明，cfNucleosomes 至少保留了一些表观遗传修饰，最近的一项研究应用染色质免疫沉淀和测序(ChIP-seq)来鉴定某些标记。此外，cfDNA 的深度测序揭示了与原始组织相关的核小体占据模式。虽然这些方法提供了对血浆中存在的丰富的表观遗传信息的第一次了解，但是到目前为止，这些信息大部分仍然无法获得，它们有很大的局限性。主要是，它们需要大量的输入材料，具有有限的动态范围(ChIP-seq)或成本高昂，并且需要深度测序。此外，这些方法具有有限的输出和灵敏度，因为它们通常测量单层信息(即 DNA 甲基化，单个组蛋白修饰或核小体占有率等)。因此，需要采用高分辨率的方法，集成来自跨越不同类型分析物的多个参数的信息。
大肠癌(CRC)是全球第三大最常见的癌症，每年导致约70万人死亡。早期转移种子最近在 CRC20中得到证实，强调了开发更好的诊断工具以改善临床结果的必要性。在这项研究中，我们开发了一种基于单分子的液体活检方法来分析来自 < 1毫升血浆样本的多个表观遗传参数。结合蛋白质生物标志物的高灵敏度检测，我们证明了其在 CRC 诊断中的价值。
我们开发了一种称为血浆分离核小体表观遗传学的技术(EPINUC; 图1a)。这项技术建立在我们最近开发的一个单分子系统的基础上，该系统通过全内反射显微镜(TIRF)对组合组蛋白修饰进行成像。TIRF 为探测固体表面约100nm 范围内的单个荧光分子提供了强有力的手段; 光源产生的倏逝波在强度上呈指数衰减，从而消除焦平面外的背景荧光。为了从血浆中捕获核小体，我们开发了对荧光标记和聚腺苷酸核小体的高效酶反应(补充图1a-e 和方法)。然后通过杂交将尾部完整的核小体固定在 PEG 化的表面上，并且通过用荧光标记的抗体的 TIRF 成像记录其翻译后修饰(PTM)的状态，验证最小的光谱重叠(图1b 和补充图1f，g)。抗体与靶 PTM 的结合和解离成像超过90分钟，利用 TIRF 狭窄的激发范围。结合事件的整合确保了修饰组蛋白的最大检测(图1c 和补充图2a)。
Transcription factor–nucleosome dynamics from plasma cfDNA identifies ER-driven states in breast cancer
雌激素受体和 FOXA1的全基因组结合图谱反映了 ER + 乳腺癌的癌症状态。然而，对肿瘤转录因子(TF)结合的常规分析在临床上是不切实际的。在这里，我们显示，血浆无细胞 DNA (cfDNA)含有高分辨率的 ER 和 FOXA1肿瘤结合概况的乳腺癌。TF 足迹在血浆中的富集反映了 TF 在起源组织中的结合强度。我们使用 ER + 乳腺癌异种移植物在血浆中定义了纯体内肿瘤 TF 特征，它可以区分具有不同 ER 状态的异种移植物。此外，状态特异性 ER 结合特征可以将人类乳腺肿瘤分为 ER 表达和死亡率明显不同的组。最后，人血浆标本中的 TF 足迹可以识别 ER + 乳腺癌的存在。因此，血浆 TF 足迹能够对人类乳腺癌的调控情况进行微创定位，并为跨多种肿瘤类型的临床应用开辟了广阔的可能性。
转录因子(TF)位于基因调控的顶端(1)。它们通常以序列特异性的方式结合小段 DNA (2)。哺乳动物基因组的大小比 TF 结合基序的大小要大几个数量级。因此，与功能性 TFBS (3)相比，随机出现的 TF 结合位点(TFBS)序列要多得多。尽管 TF 如何区分功能性结合位点与随机基序出现的问题仍在积极研究中(4,5) ，但至少有两种机制使我们能够将 TF 结合与细胞状态联系起来。首先，TF 的细胞类型特异性表达限制了在给定细胞类型中识别的基序池。其次，基因组中的大多数基序在大多数时候都被核小体所封闭(6,7)。因此，在基因组中的位点结合任何特定的 TF 有助于表观基因组签名的细胞类型。此外，由于功能性 TF 结合驱动基因调控，因此在细胞中定位 TF 的结合位点也有助于理解细胞的调控景观(8)。使用诸如 DNA 测序(chIP-seq)、, chromatin immunoprecipitation, exonuclease digestion and DNA sequencing (ChIP-exo), 以及靶标下切割和核酸酶释放(CUT & RUN)等方法已被用于鉴定跨细胞类型的人类转录因子的结合位点(9-11)。
将全基因组 TF 结合景观与细胞状态联系起来，在 TF 驱动的疾病如雌激素受体阳性(ER +)乳腺癌中获得了额外的重要性。在 ER + 乳腺癌中，ER 所占据的所有可能结合位点的子集反映了疾病预后。此外，内分泌治疗通过调节内质网结合，去除配体或降解内质网，导致内质网结合的全面变化，在某些情况下，甚至增加内质网在染色质上的停留时间(14)。ER 结合还取决于先驱因子 FOXA1。内分泌治疗期间内质网切除后，FOXA1的表达和结合可能持续存在，可能导致治疗抵抗。总之，ER 和相关因素的结合特征的全基因组图谱可用于确定疾病状态，预测治疗结果，并可能选择有效的治疗。然而，由于获得肿瘤组织的风险，目前在临床上不可能进行 TF 结合的常规和连续定位。在这里，我们利用一种替代手段，以最小侵入性的方式从 ChIP 或 CUT & RUN 获得相同的信息，以定义潜在的疾病生物学。
人体内的死亡细胞将其内容物释放到血液中(16)。被核小体和转录因子结合的基因组 DNA 逃脱内源性核酸酶，因此在血浆中仍然受到保护(图1A)(17)。人体淋巴细胞和骨髓细胞的周转规律是血浆中无细胞 DNA (cfDNA)库的主要贡献者(18)。然而，在癌症存在的情况下，可检测到的部分 cfDNA 来自肿瘤(19,20)。这表明 cfDNA 具有实时定位肿瘤表观基因组的潜力，因此可以帮助揭示来自血浆的癌症调控景观。片段组学试图利用 cfDNA 片段长度的信息揭示 cfDNA 起源的组织。片段组学最早应用于产前诊断，目前正在探索作为突变和甲基化分析的替代方法，以鉴定癌症起源的 cfDNA 组织(21-23)。已经使用 cfDNA 特性如启动子核小体动力学，基因座特异性片段长度分布，基因体中的核小体间距和启动子处的核小体消耗来鉴定 cfDNA 的起源组织以帮助检测癌症(17,24,25)。因为转录因子和核小体保护明显不同长度的 DNA，cfDNA 促进蛋白质-DNA 相互作用的直接定位在它们的起源细胞(17)。来自 cfDNA 的 TF 结合也已经在数千个推定的位点上得到了平均拥有属性，或者是通过观察短期保护(17) ，或者是通过推断 tFBS 的核小体消耗来结合 TF (26)。然而，将单个结合位点分类为 TF 结合位点或核小体结合位点，然后从 cfDNA 数据中发展出调控标记，这在以前从未尝试过。这种调控特征有可能区分不同的 TF 驱动的癌症状态。
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