在生物的基因组中存在一类特殊的DNA序列,它们能够作为独立的单位从基因组的一个位置移动到另一个位置,这种能够改变自身位置的DNA序列被称为转座子(transposons)。所有的转座子都有两个基本特征。首先,转座子的两端为反向重复序列(inverted repeat)。第二,转座子至少含有一个编码转座酶(transposase)的基因。很多转座子还携带有与转座不相关的基因,例如抗生素抗性基因、毒性基因等。这些基因位于转座子内,随转座子一起从一个DNA分子移动到另一个DNA分子,对基因组的进化产生了十分重要的影响。根据转座子的结构及其转座机制,可将其分为3个家族,即DNA转座子、类病毒反转录转座子和非病毒反转录转座子。DNA转座子在转座的过程中一直保持DNA的形态,后两种反转录转座子的移位都需要一个暂时性的RNA中间体。
一、DNA转座子
(一) 细菌的DNA转座子
1. 插入序列 (insertion sequences, IS )
插入序列是最简单的转座子。典型的插入序列长750~1500 bp,具有10~40 bp长的末端反向重复序列。IS元件的两个末端并非是十分精确的反向重复序列。所有的IS元件都含有一个编码区,它编码的转座酶能识别IS元件的末端重复序列,为一种介导转座过程关键蛋白质组分。转座酶对IS元件两个边界的识别保证了IS元件作为一个整体在基因组中移动。
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IS元件位于细菌的染色体上,也存在于噬菌体和质粒的DNA分子中。在大肠杆菌的染色体中发现了几个拷贝的IS1、IS2和IS3。F因子中没有IS1,但有一个拷贝的IS2和两个拷贝的IS3。当质粒和染色体上具有相同的IS元件时,质粒可以通过同源重组整合到宿主细胞的染色体上。
2. 复合转座子 (composite transposon )
中心区携带有抗药性标记(Drug marker),两侧有被称为模块(module)的IS元件或类IS元件。每个IS元件都有以倒转重复序列为末端的一般结构,所以复合转座子也是以同样的倒转重复序列为末端的。有些复合转座子两侧IS序列是相同的 ,另一些例子中,模块高度同源但不相同。与IS序列一样,复合转座子的转座也会在靶基因组中产生短的正向重复。
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3. Tn3
Tn3代表另一类更为复杂的转座子。这类转座子的两个侧翼序列不是IS或类IS序列,而是短的倒转重复序列;Tn3的反向重复序列的长度是38bp。在两个倒转重复序列之间有3个基因。
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(二) 转座的分子机制
转座子可以通过两种机制进行转座。一种是保守型转座(conservative transpositin),一种是复制型转座(replicative transposition)。在保守型转座中,转座元件从供体位点上切除,然后插到靶位点上,因此这个机制又叫做剪切-粘贴转座(cut-and-paste transposition)。在复制型转座中,转座子被复制,转座的DNA序列是原座因子的一个拷贝,而不是它本身。因此,复制型转座伴随着转座子拷贝数的增加。
1. 保守转座
某些细菌转座子,包括很多IS元件和复合转座子,都是通过一种称为剪切-粘贴机制进行转座的。这种相对简单的机制是一个保守的过程,即只有靶序列被复制,而原始的转座子则不发生复制。
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2. 复制型转座
进行复制型转座的转座子除了具有编码转座酶的基因外,还具有编码解离酶(resolvase)的基因以及解离酶的作用位点,即内部解离位点(internal resolution site, IRS)。
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(三) 转座频率的调控
转座频率的调节对于转座子来说十分重要,一个转座子必须能维持一个最低转座频率才能存活,若频率太高会损伤宿主细胞。因此,每个转座子都有调控其转座频率的机制。
转座酶在转座过程中发挥着关键作用,一些转座子,比如Tn10,可以通过控制转座酶的合成调控转座发生的频率。限制转座子转座频率的第二个途径是把转座过程局限在细胞周期的某一特定阶段。Tn10的两个末端反向重复序列,以及转座酶基因的启动子中各有一个GATC位点。我们知道,新合成的DNA分子的GATC位点是半甲基化的。RNA聚合酶和转座酶与半甲基化序列的结合能力要比与完全甲基化序列的结合能力强。所以,半甲基化的DNA不但能够激活Tn10的转座酶基因的启动子,还能够增强转座子末端的活性。结果,在DNA复制后的短暂期间,Tn10更容易发生转座。
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海星生物 VIRUS-Free™技术
VIRUS-Free™ 是一种利用转座子系统进行细胞稳转株的构建和筛选的技术,经过海星生物的精心优化,特别是针对TR序列和转座酶的体系的优化,使得VIRUS-Free™技术成为一直能够替代慢病毒感染构建稳转细胞株的技术。其载体中包括了转座子的识别区域,在转座酶的催化下,将目的片段从载体上或者BAC分子上切割下来形成一个小环结构,并在基因组里面的固定序列位置进行插入,从而实现稳转。目前已经在CAR-T细胞治疗中得到较多的临床应用,并充分体现出其:低成本、高效率、基因表达稳定的特点。
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