众所周知，下肢缺血是一种严重的临床症状，影响着世界上很多患者，目前尚无有效的治疗方法。下肢缺血是因缺血而激活NLRP3炎性体，进而通过释放炎症性细胞因子IL-1β和IL-18触发组织损伤。然而，激活NLRP3炎性体的分子机制在很大程度上仍然未知。
近日，来自中国苏州大学、广州医科大学、阜外医院、中山大学和吉林大学第二医院等机构的的研究人员发表了一项新研究，他们发现Rb1蛋白在骨骼肌中有着NLRP3炎症体诱导剂的作用，通过E2F/AMPKα2介导的信号通路可下调Rb1来阻止NLRP3炎性体的激活,而UMSC-Exos可以补充缺血肌肉中cPWWP2A的丢失。该研究揭示干细胞外泌体修复缺血性肌肉损伤机制。相关研究结果发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊上。
图片来源《Signal Transduction and Targeted Therapy》
在这项研究中，研究人员利用RNA测序（RNAseq）比较了缺血的肌肉和正常肌肉的mRNA表达，发现Rb1（retinoblastoma-1）、NLRP3炎性体、IL-1β和IL-18的mRNA水平增加。对这些上调的基因进行基因本体分析，揭示了缺血肌肉中与炎症反应途径和NLRP3炎性体相关的生物学过程，从而证实炎症相关信号通路参与缺血诱导的肌肉损伤。
研究人员还进行了蛋白测序，相关分析显示，缺血肌肉中Rb1、NLRP3、IL-1β和IL-18存在良好的蛋白-mRNA相关性。Rb1蛋白是一种已知的肿瘤抑制蛋白，Rb1的失活会促进骨骼肌细胞的增殖，但是研究人员并不了解Rb1在缺血性肌肉损伤中的作用。
为了弄清楚这个问题，研究人员构建出肌肉特异性Rb1基因敲除（Rb1-mKO）小鼠。在缺血性后肢损伤后，Rb1-mKO小鼠与对照组小鼠进行比较，发现血流恢复比较快，肢握力、耐力以及骨骼肌与体重的比值也较高。这一结果表明，Rb1基因的丢失可以促进损伤后的骨骼肌修复。此外，还发现Rb1基因的缺失导致NLRP3信号通路受到抑制。
为了证实这些发现，研究人员建立了炎性体激活的体外模型。利用STRING数据库鉴定出调控Rb1的上游信号分子，发现它与CDK6和转录因子E2F相互作用。双荧光素酶实验证实CDK6是miRNA-29b的靶点。而miR-29b模拟物抑制了C2C12细胞中CDK6蛋白的表达和Rb1蛋白的磷酸化。
接下来，研究人员试图了解miR-29b是如何被调控的，他们使用环状RNA （circRNA）测序来比较缺血肌肉和正常肌肉中circRNA的表达。在缺血肌肉中检测到几种促进细胞增殖的circRNA（cPWWP2A、circ_CCDC66和circ_HECTD1）。在这些circRNA中，cPWWP2A的表达最强，但在缺血条件下，它的表达量急剧下降。这些发现在qRT-PCR实验中得到证实。
由于干细胞衍生的外泌体可以促进组织修复，研究人员将对照外泌体(NC-Exos)或沉默cPWWP2A表达的外泌体（si-Exos）注入缺血肌肉，以确定cPWWP2A是否参与介导源自人脐带衍生间充质干细胞（UMSC）的外泌体（UMSC-Exos）在肌肉中的有益作用。
结果发现，NC-Exos处理导致肌肉中cPWWP2A的表达增加，而si-Exos减弱了这种表达。与注射NC-Exos的小鼠相比，si-Exos处理导致血流恢复较慢，运动功能较差，肌肉力量和跑步距离减少，肌肉与体重比降低，NLRP3、Caspase-1表达较高，血浆中IL-1β和IL-18水平增加。
基于CircBank分析，研究人员确定了miR-29b和cPWWP2A之间的相互作用。cPWWP2A和miR-29b之间的联系在双荧光素酶实验中得到证实，该实验显示miR-29b与cPWWP2A存在较强的结合。miR-29b在缺血肌肉中的表达增加了，这与cPWWP2A的表达相反。这些结果表明，cPWWP2A是miR-29b的分子海绵（molecular sponge）。
为了验证cPWWP2A/miR-29b调控NLRP3信号通路，用miR-29b抑制剂处理C2C12细胞，这降低了NLRP3和Caspase-1的表达以及IL-1β和IL-18的释放，但增强了C2C12细胞增殖，不过这些效应可被si-Exos逆转。相应地，敲降C2C12细胞中的cPWWP2A导致CDK6 mRNA和蛋白的表达减少。此外，C2C12细胞的分化被cPWWP2A siRNA抑制，但被miR-29b抑制剂激活。这些数据表明，cPWWP2A通过miR-29b/CDK6途径调节Rb1。
以前的研究已表明，Rb1的下调导致E2F转录因子的释放，进而激活AMP激酶α2（AMPKα2）的转录。AMPKα2抑制平滑肌细胞中NLRP3的激活。研究人员试图确定Rb1是否调节骨骼肌中AMPKα2的表达。结果证实，Rb1的下调是通过激活AMPKα2来抑制NLRP3的激活。
该研究表明，Rb1蛋白通过cPWWP2A/Rb1/AMPKα2/NLRP3信号通路调节NLRP3炎性体。重要的是，UMSC-Exos可以补充缺血肌肉中cPWWP2A的丢失。研究人员表示，Rb1基因敲除方法可以通过使用释放cPWWP2A以促进肌肉修复的UMSC-Exos转化为临床应用。
资讯出处：
[1] [endif]Yanli Wang,Wenping Xie,et al.Stem cell-derived exosomes repair ischemic muscle injury by inhibiting the tumor suppressor Rb1-mediated NLRP3 inflammasome pathway[J].Signal Transduction and Targeted Therapy,2021,(3).
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