从2020年开始，我的基因编辑系列都会在我的好友果子老师的公众号上首发，他还会为文章写相应的引言等等。但我会把我的原始手稿放在简书上备份一次。由于第一年学习考试特别多，就停更了很久，最近应该会恢复更新。上次我写了解剖式学习一个质粒结构--update。试图在一篇文章中，快速学习质粒结构。思来想去，学习总不能一蹴而就；另外，在见识到本学院博士生PAC和QE过程中评委提问的内容之细节，顿觉现在要开始准备了（评委们真的会请答辩者描述ZFN、TALEN和CRISPR的区别）。于是打算开启一个质粒系列，希望借此补充个人的背景知识，也同样希望大家不吝赐教。
1. 质粒简史
命名由来 如不踏入生命科学领域，我们对质粒的了解只有高中生物课上所提到的：质粒是处于细胞质内环状的DNA。20世纪40年代和50年代，科学家们致力于研究可以在细胞间转移的遗传因子，其中Joshua Lederberg 因在基因重组和细菌遗传物质方面的发现获得1958年诺贝尔生理学或医学奖。Joshua早在1952年曾为这些可在细胞间转移的遗传物质命名为plasmid，其由cytoplasm和拉丁文中的id (it的意思)组成，意为染色体外遗传因子的总称。plasmid曾一度被episome（游离基因）替代，直到后来人们发现细胞质内遗传物质无法整合到基因组内，plasmid的名字才被重拾回来。
如何风靡 尽管在1950年代质粒已经被发现，然而质粒进入实验室作为研究工具则等了20年，在这期间，科学家们主要使用的研究工具还是噬菌体。知道1972年的某一天，Stanley Cohen（1986诺贝尔生理学或医学奖获得者）和几个科学家在唠嗑的时候，聊到最近刚发现的限制性内切酶EcoRI，于是他们在餐巾纸上写下实验设计：将四环素抗性质粒pSC101和卡那霉素抗性质粒pSC102经由EcoRI处理后转入大肠杆菌，可能可筛选到双重抗性的大肠杆菌。而这个实验大获成功，成为历史上第一个质粒克隆实验。从此，质粒+限制性内切酶的组合大放异彩，现如今是再平常不过的工具了。
2. 什么是质粒
质粒是可独立于染色体自行复制的环状DNA，常在在细胞、古生菌及真核生物中出现，质粒的存在可为细胞体提供一些特殊的功能，例如抗生素耐药性、毒性等等。所有的天然质粒都有一个复制起点（origin of replication，它控制着质粒的宿主范围和拷贝数），通常还包括一个有利于生存的基因，如抗生素抗性基因。目前实验室中使用的质粒通常是人为的，旨在引入外源性基因，这些质粒至少要有复制起点、筛选标记和克隆位点。
plasmid map
由于其人工性质，实验室质粒通常被称为载体（vector）或构建体（constructs）。质粒构建方法有很多种：restriction enzyme, ligation independent, Gateway, Gibson等等，我们后面会一个个谈到。克隆方法的选择取决于质粒的结构，常见的质粒类型有: 克隆质粒、表达质粒、基因敲除质粒、报告质粒、病毒质粒、基因组工程质粒等等。而如何选择质粒载体、工具等等相关内容，希望我们能更新到这部分内容。下面我们就质粒每个元件进行简单的介绍。
plasmid elements
2.1 origin of replication (ORI)，复制起点
参考上 面我们提到的文章都是基本功！和春卷一起看图学质粒。Ori的概念要和启动子区别开来，Ori对应的是质粒本身的复制，而promoter对应的则是基因的转录，Ori的强度决定该质粒在细菌中的产量，而promoter则决定基因的表达能力。因此选择Ori时主要依据我们对拷贝数和宿主的需求。
ORIs
2.2 promoter 启动子
Ori决定着质粒在细胞中的产量，而此时启动子则介导基因的转录，一般来说启动子这一词包括了启动子和反应原件操纵子（operators）。启动子区域的序列控制着RNA聚合酶和转录因子的结合，因此启动子决定着基因表达的时间和地点。
promoter介导的DNA转录至RNA过程依赖于RNA聚合酶（RNA polymerase，RNAP）。在原核生物中，这部分相对简单，而真核生物则根据不同聚合酶有不同的转录结果。这意味着启动子必须兼容所需的RNA类型， 如果你想让基因表达，即转录mRNA，则此时需要RNAP II；而如果仅仅是要转录出RNA，例如shRNA，CRISPR-Cas9所需的gRNA，此时我们需要的是RNAP III，而在病毒中则是LTRs，具体可以参考慢病毒相关文章：慢慢的慢病毒，给我快快的用起来！
transcription promoter gene
同样，根据质粒宿主的不同，启动子的类型也会不同。真核生物启动子有持续激活型（constitutively active）和严密调控型（carefully controlled），此外，启动还会被增强子、绝缘子等原件调控：
eukaryotic_promoters
常规真核生物启动子：
| Promoter | Expression | Description |
|---|---|---|
| CMV | Constitutive | Strong mammalian promoter from human cytomegalovirus |
| EF1a | Constituitve | Strong mammalian promoter from human elongation factor 1 alpha |
| CAG | Constitutive | Strong hybrid mammalian promoter 人工合成的启动子 |
| PGK | Constitutive | Mammalian promoter from phospholycerate kinase gene |
| TRE | Inducible | Tetracycline response element promoter 四环素诱导激活 |
| U6 | Constitutive | Human U6 nuclear promoter for small RNA expression |
| UAS | Specific | Drosophila promoter containing Gal4 binding sites |
常规原核生物启动子：
| Promoter | Expression | Description |
|---|---|---|
| T7 | Constitutive but requires T7 RNA polymerase | Promoter from T7 bacteriophage |
| Sp6 | Constitutive but requires Sp6 RNA polymerase | Promoter from Sp6 bacteriophage |
| lac | Constitutive in the absense of lac repressor (lacI or lacIq). Can be induced by IPTG or lactose | Promoter from Lac operon |
| araBad | Inducible by arabinose | Promoter of the arabinose metabolic operon |
| trp | Repressible by tryptophan | Promoter from E. coli tryptophan operon |
| Ptac | Regulated like the lac promoter | Hybrid promoter of lac and trp |
2.3 Terminator and Poly A singnals 终止子和PolyA信号
Ori完成质粒复制，promoter启动基因转录，基因开始转录后经过延伸，最后必须在正确的位置终止。终止子（terminator）位于被转录基因的下游，通常在任何3'调控元件之后，如PolyA信号。这里有几个概念需要放在一起比较：
（1）promoter 启动子：这是一段和RNA聚合酶特异性结合的DNA序列，它位于起始密码子的上游，启动子本身并不转录，只是启动转录。
（2）terminator 终止子：提供转录终止信号的DNA，这部分DNA转录出来的RNA带有茎环结构（发夹结构），从而造成转录的终止。因此导致转录终止的不是DNA序列，而是DNA转录出的RNA结构。
（3）start codon 起始密码子：肽链翻译的第一个氨基酸的密码子，通常为AUG 甲硫氨酸。
（4）stop codon 终止密码子：肽链翻译的终止信号密码子，它们有非常华丽的名字：包括琥珀密码子(UAG)、赭石密码子(UAA)、欧珀密码子(UGA) 。
区别：启动子和终止子是DNA向RNA转录层面的调控因子，均为非编码区的DNA序列；起始密码子和终止密码子都是mRNA上的氨基酸序列。表述时建议使用英文名字而非中文，因中文容易混淆。
原核终止子
主要用Rho-依赖和不依赖两种方式：（1）Rho是一种解旋酶，它协助RNA聚合酶在转录本的终止；（2）Rho非依赖途径依赖于RNA转录本中的GC-rich发夹结构，发夹-DNA复合体破坏转录复合体的稳定，启动转录本的分裂，此为质粒中常见的终止方式。
2.3.1 真核终止子
真核生物的终止子要对应其相应的启动途径，主要是RNA聚合酶的区别：
| Promoter | Product | Terminator |
|---|---|---|
| RNAP I | ribosomal RNA | 类似原核生物Rho依赖途径，需要相应的解旋酶 |
| RNAP II | mRNA , miRNAs | RNA聚合酶相关蛋白CPSF和CstF，负责招募切割和聚腺苷化酶 |
| RNAP III | tRNA, short RNAs | 类似原核生物Rho非依赖途径，需要特殊的RNA序列诱导转录本的断裂 |
哺乳动物表达质粒主要用于转录mRNA，常用的终止子SV40、hGH、BGH和rbGlob包含AAUAAA序列，可促进Poly A化，从而导致信号终止，如下：
RNAP II
终止子的终止效率并不是百分之百，为保险起见，终止信号可以多加一到两个。
3. 小结
今日简单介绍了质粒的基本元件，涵盖质粒复制起点，质粒转录的起始和结尾，算是有头有尾，这每一个元件对于质粒骨架的选择都十分重要，因此即使是非常基本的内容，但还是需要着重强调。接下来我们会依据今日所学尝试去选择合适自己的质粒，并在酶切上花费一定心思。我们总是在路上，每一天都要为新学到的知识感到快乐，共勉！
网友评论