Deciphering the Immune Modulation through Deep Transcriptomic Profiling and Therapeutic Implications of DNA Damage Repair Pattern in Hepatocellular Carcinoma
期刊：cancer letters
影响因子：9.756
作者：复旦中山医院、广东省人民医院、非因生物
研究背景和目的
DNA损伤修复（DDR，DNA damage repair）在肝细胞癌（HCC，Hepatocellular carcinoma）中起着至关重要的作用，DDR基因突变积累诱导全基因组不稳定，从而促进肿瘤发生和发展，DDR通路的改变也会影响免疫治疗的疗效。然而，DDR介导的免疫细胞以及免疫调节通路在HCC中的具体机制尚不明了。因此，更深入地了解TME与DDR之间的相互作用以及不同DDR状态下的动态免疫生态系统，有助于解决HCC先天免疫应答的异质性和相关基质，并有助于制定更有效的治疗策略。
研究思路
实验结果
1、HCC中恶性细胞的DDR异质性分析
通过scRNA-seq、bulkRNA-seq、RPPA分别从单细胞转录组、蛋白质水平深入分析HCC中恶性细胞和TME之间的相互作用（图1A）。为了揭示导致患者间异质性的主要细胞成分，对每个细胞群落进行了聚类和注释。HCC TME的组成主要由肝细胞、B细胞（BCs）、CD4+ T细胞（CD4s）、CD8+ T细胞（CD8s）、自然杀伤细胞（NKs）、树突状细胞（DCs）、巨噬细胞、内皮细胞（ECs）和成纤维细胞（Fibs）构成（图1B）。样本间细胞组成比较结果表明样本间的异质性，但上皮细胞和免疫细胞在正常和癌变组织间显示出明显的组织来源差异（图1C）。9个肿瘤样本9957个恶性细胞的拷贝数变异结果显示出肿瘤间异质性的同时也突出了样本组织间恶性细胞预先存在的生物差异（图1D和图1D）。为了量化恶性细胞的DDR状态，对9957个恶性细胞进行了高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA)，结果确定了19个基因模块（K=5），并从中选择3230个与TNM分期显著相关的基因作为肿瘤进展的关键指标（图1F）,其中已知56个基因参与了DDR过程（图1G）。研究者用这56个共有基因开了DDR打分，以定量恶性细胞的DDR状态。通过此打分系统发现，以晚期HCC相比，早期HCC的DDR活性水平显著更高（图1H）。通过DDR打分将样本分为高DDR（DDR分值＞0）和低DDR组（DDR分值＜0）（图1I）。基因集富集分析结果显示，低DDR组P53和TRAIL通路上调而EGFR、PI3Ks通路下调，验证了DDR分类的准确性（图1J）。综上，恶性细胞的DDR具有显著的肿瘤异质性，可能导致了肿瘤的进展。
图1
2、不同DDR条件下HCC中TME生态系统的不同分布全景
在不同的DDR条件下，肝细胞癌（HCC）肿瘤微环境（TME）的特征存在显著差异。研究者基于患者水平的DDR分类，获得单细胞水平下高DDR和低DDR的TME（图2A）；OR统计分析结果显示，NK细胞与“低DDR”组的关联性最强，但B细胞似乎在“高DDR”组中富集最多（图2B）；NK细胞亚型的无监督聚类树结果表明，在其中有一个稳定区域，并分为6个亚群SPP1+ NKs、 LDLRAD4+ NKs、GSTA1+ NKs、IGLC3+ NKs、IRF8+ NKs 和 FCGR3A+ NK（图2C-E）；大多数的NK亚群来自“低DDR”组，而高DDR”组 以GSTA1+ NKs、IGLC3+ NKs 为主（图2F）。另外，B细胞分为 CD20+ B 细胞和 CD138+浆细胞两个亚群，且CD20+ B 细胞在“低DDR”组占比更高（图2G）；GSEA显示了两种B细胞亚型的高DDR组和低DDR的关键富集通路（图2H-K）。总的来说，本研究结果支持 NK 和 B 细胞通过重新编程免疫生态系统和代谢过程来调节 HCC 致癌性从有效 DNA 修复状态（DDR-高）到功能受损状态（DDR-低）的转变。
图2
3、免疫检查点阻断后高DDR介导的免疫抑制的特征
由于HCC在不同DDR状态下具有不同的免疫调节模式，因此研究者试图进一步探讨DDR与免疫治疗应答之间的关系。未接受免疫治疗和接受免疫治疗（抗PD-1阻断剂）HCC单细胞数据集的细胞注释识别到上皮细胞，包括恶性细胞和非恶性细胞，主要的免疫细胞和基质细胞包括B细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞（图3A）；此外，与非免疫治疗组相比，免疫治疗组的恶性肿瘤少和更多的CD8+T细胞，且免疫治疗后肿瘤细胞比例下降（图3B-C）。非免疫治疗组UMAP结果表现出相当大的肿瘤间异质性，而免疫治疗后的HCC样本间的异质性降低（图3D）。通过自研DDR评分模型将免疫治疗组分为高DDR组和低DDR组，UMAP结果显示不同的DDR状态具不同的TME，免疫表型有所改变（图3E）；进一步对按DDR状态分层的恶性细胞群进行了差异和功能分析观察到“低DDR”组激活了脂肪酸代谢通路，激活了WNT通路，可能致癌MYC激活（图3F-G）;为了探索EMT如何介导DDR的转变，研究者绘制了肿瘤细胞的进化轨迹。拟时序推断出从恶性细胞簇开始逐渐分化成成纤维细胞的趋势，这表明在DDR活性条件下纤维化TME形成可能发挥作用（图3H）;通过对免疫调节通路中关键调控分子的分析，发现在DDR低下患者的体内存在一种普遍的免疫炎症趋势，同时在“低DDR”组患者的CD8+ T细胞中，LAG-3的表达显著升高；至于免疫刺激分子，肿瘤坏死因子（TNF）相关的家族信号被特别富集，这表明DDR损伤可能会引发连续的肿瘤杀伤作用；在“高DDR”组中T细胞/B细胞通信呈现上调趋势；同样，在“低DDR”组患者中，具有细胞类型特异性的MHC II类分子（仅限于B细胞、DCs和巨噬细胞介导）也同时上调（图3I）。综上，以DDR评分为特征的DNA损伤应答（DDR）状态在区分接受ICI免疫疗法的肝细胞癌（HCC）患者肿瘤微环境（TME）中具有一定的调控作用。
图3
4、CXCL10-CXCR3信号轴诱导DCs在低DDR状态下交叉呈递抗原并识别CD8+ T细胞
ICI治疗患者不同DDR状态下特定细胞类型内配体-受体之间的分子相互作用明显，TME细胞-细胞通信经历了动态重编程。“高DDR”组通过成纤维细胞-内皮轴集中，而“低DDR”组则完全向巨噬细胞主导的模式转变（图4A-B）;ICI治疗后，低DDR”组巨噬细胞、DC、NK细胞的通信正常（图4B-C)；低DDR”组中，CD8+ T细胞是一个关键的相互作用因子，可能参与多个细胞通信对话（图4D）。在“低DDR”患者中发现的具有高CXCL10表达特征的DC的中心介质与CD8+ T细胞表面受体CXCR3的共表达最高（图4E）；IFNG可以通过转录因子调节包括GATA3，REL和TBX21揭示的关键作用CXCL10-CXCR3轴在招募DCs和CD8+ T细胞交互和调解CD8+ T细胞渗入肿瘤。（图4F）同时，描述了免疫治疗后以DDR状态为特征的HCC TME的动态变化（图4G），探讨了未来有待开发的潜在治疗策略。
图4
5、DDR预测HCC的预后和免疫治疗的反应性
研究者通过单细胞RNA测序提取了56个与DNA损伤修复(DDR)相关的关键基因，并利用外部bulk RNA测序数据集开发了一种基于机器学习的DDRscores评分系统。采用LOOCV框架来确定最优预测模型。研究者发现，最佳预测模型为Lasso+RSF组合，平均C指数达到0.843。将患者分为“高DDR”组和“低DDR”两组。“高DDR”患者的总生存期(OS)显著低于“低DDR”患者。此外，通过对DDRscore与免疫疗法响应关系的研究，研究者利用TIDE算法在三个独立队列中发现低DDRscore可能与PD-1治疗响应正相关，而高DDRscore则倾向于对PD-1抑制剂无效。综上，通过量化DDR状态评估构建的DDRscore模型有可能成为预测肝癌患者受益于免疫疗法的一个重要指标。
图5
6、通过B-Raf信号通路抑制疗法针对具有高DDR评分的HCC患者
针对DDR得分高的HCC（肝细胞癌）患者，研究者计算了22种HCC细胞系的DDRscores，并从TCGA-LIHC队列中检索了反相蛋白质阵列（RPPA）数据，将单个患者的DDRscores与其配对的RPPA蛋白组学数据相关联。他们发现B-Raf表达与DDRscore呈正相关（图6B）。接下来，研究者利用CERES分数评估了个别基因依赖性与DDRscore之间的相关性，基于22种肝癌细胞系的分析再次确认BRAF基因是一个重要的高DDR得分预测因子。因此，针对DDR得分高的HCC患者，通过抑制B-Raf通路可能会成为一种潜在的治疗策略。
图6
本研究通过DDR状态量化评估生成的DDRscores模型为HCC患者的预后判断和免疫疗法选择提供了有价值的信息。DDR的改变可能通过影响免疫细胞的功能和分布来影响HCC的发生和发展。
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