上个月online的一篇nature。在这篇文章中，作者对来自11个DCM患者心脏、15个HCM患者心脏和16个non-failing hearts的左心室样品进行了单核细胞测序。DCM和HCM的心脏转录图谱在组织和细胞水平具有广泛的重合。
DCM和HCM的各种图谱类单细胞文章其实都出了一些了，之前也写过一些：
单细胞核测序揭示扩心病儿童细胞特征调节的新机制
单细胞核测序和空间转录组解析肥厚性心肌病的心脏病理性重构的谱系特异性调节改变
单细胞转录组解析肥厚性心肌病发病机制
这一篇依然可以发nature，说明它肯定有非常值得学习的地方。
Fig 3
1. Expression profiles of cardiomyopathies
作者对11个DCM患者心脏、15个HCM患者心脏和16个non-failing hearts的左心室样品进行了单核细胞测序。DCM患者的LVEF都<20%，HCM患者中，7个LVEF<50% (HFrEF)，8个LVEF>=50% (HFpEF)。
Fig 1A, B：质控后得到592,689个细胞核，根据转录相似性聚为了21个群。B图相似性聚类树的算法可以参考不同单细胞群之间的相关性分析。
得到的细胞类型还挺全的，正常心脏里的细胞类型参考：人类心脏单细胞图谱和单细胞测序揭示小鼠心脏非心肌细胞之间的异质性和互作。
Fig 1C：不同样品的细胞比例，可以看到样本间的异质性还是比较大的。整体上细胞丰度依次是心肌细胞，成纤维细胞，内皮细胞，壁细胞，巨噬细胞和淋巴细胞。和NF相比，DCM和HCM心脏出现了明显的心肌细胞比例下降以及血管平滑肌和活化成纤维细胞比例的增加。此外，和NF相比，DCM心脏出现了明显的成纤维、淋巴和巨噬细胞的增加，HCM则出现了淋巴管内皮细胞的增加。
Fig 1D：这个图是一个pseudo-bulk sequencing的PCA分析，可以看到PC1把NF和DCM, HCM区分开了，PC2把性别区分开了。DCM和HCM则不能很好的区分开。（参考：转录组表达矩阵为什么需要主成分分析以及怎么做）
Fig 1
Extended Data Fig. 4 |Compositional changes of global cell types.
这个比例变化的比较是用scCODA做的
随后作者比较了一下NF和心肌病的转录差异
Fig 2A：作者比较了 DCM vs NF, HCM vs NF, DCM vs HCM的总的差异基因。从bulk水平来看，DCM vs HCM的差异基因显著少于DCM vs NF和HCM vs NF，与前面1D的pca结果相一致。
Fig 2B： DCM vs NF, HCM vs NF, DCM vs HCM的bulk的差异基因和各细胞类型的差异基因。可以看到成纤维的差异基因是最多的。DCM和HCM在各个细胞类型中的差异基因也比较少，在新肌里面稍微多那么一点点。提示心肌病也能存在着类似的转录模式，这也和前面基于蛋白组学的研究相一致1。
这里的差异基因计算都是用的
false discovery rate (FDR) < 0.01
FDR其实就是矫正后的p值
为了进一步探究心肌病患者的转录差异，作者比较了HFrEF和HFpEF的HCM样品。在FDR<0.01的标准下，所有的细胞群都没有鉴定出差异基因。
Fig 2C： 随后作者探索性的探究了在心肌中存在差异表达的基因中具有性别差异的基因。鉴定出了包括THRB在内的5个基因 (FDR < 0.10)在心肌细胞状态和患者性别不同的情况下存在表达差异。提示一小部分基因可能在不同性别心肌病患者中存在功能差异（？？？前面算差异基因还是用的FDR < 0.01，到这里就变成0.1了？p.adj都放宽到0.1了，还只有五个差异基因，这个图也值得放在主图吗？前面算HFrEF和HFpEF的HCM样品的差异基因怎么不把FDR卡到0.1呢？）
Fig 2D： 基于DCM和HCM跟NF相比 各细胞类型的差异基因，作者做了通路富集分析（画法参考一张图展示多组富集分析结果）。整体上看， DCM vs NF和HCM vs NF的差异基因富集到的通路在各细胞类型中都比较相似。此外，心肌细胞不管是上调还是下调的pathway，p值都不是那么显著，NES也比较接近于0，也就是说上调下调的变化比较轻微。相反，成纤维的多条通路出现了显著变化，包括补体系统、中性粒细胞脱颗粒、维生素和辅因子代谢、钾离子通道和神经系统等。相似的，巨噬细胞出现了多条通路的显著下调，包括中性粒细胞脱颗粒、第二信使分子的产生和CD28家族共刺激分子的生成等。
Fig 2
为了探究DCM和HCM的转录差异是否是由基因背景导致的，作者对42例患者样品中的40例进行了全外显子测序，以期在已知的心肌病基因中鉴定loss-of-function (LOF)变异。（看起来像是文章修回的时候补的数据）
Extended Data Fig. 6a： 和预期一致，作者在DCM中观测到了TTNLOF carriers (4 out of 10 patients)，HCM中的MYBPC3LOF carriers (3 out of 15 patients)和MYH7 pathogenic variant carriers (5 out of 15 patients)。
Extended Data Fig. 6b-d：然而carriers和non-carriers之间没有明显的转录差异。
Extended Data Fig. 6
2. Changes in cell subpopulations
随后作者对丰度比较高的几个细胞群进行了二次聚类。和NF相比，作者在HCM或DCM的成纤维，巨噬，内皮，VSMC和淋巴细胞中都发现了至少1个亚群的显著比例变化。
比如内皮亚群EC-TMEM163在HCM和DCM中都出现了上升。这个细胞群高表达促血管生成的基因比如KIT, NRP2, COL15A1, PCDH17和ITGA6。相似的，淋巴细胞中的LC-LINGO2在HCM和DCM中都出现了比例上升。和其他淋巴细胞相比，这个淋巴细胞群高表达NK细胞marker如KLRF1, GNLY, CD244和PRF1。
Extended Data Fig. 7
在巨噬细胞中，作者鉴定出了4个亚群（Extended Data Fig. 8a-d）。其中Prolif巨噬在HCM和DCM中都出现了比例下降（Extended Data Fig. 8e）。巨噬细胞marker CD163和增殖marker Mki67共染证实了这个现象（Extended Data Fig. 8f）。随后根据CCR2对细胞进行划分结果发现Prolif巨噬在基因表达上类似于修复性CCR2-组织原位巨噬细胞（Extended Data Fig. 8g-i）。
g图和i图的画法可以参考：scRNAseq灵活的点图绘制：FlexDotPlot
Extended Data Fig. 8
3. Activated fibroblasts in DCM and HCM
在前面的Fig 1c和Extended Data Fig. 4作者发现了DCM和HCM患者都出现了明显的活化成纤维比例的增加。而且这群细胞几乎只存在于心肌病患者(2,989 DCM, 2,196 HCM and 25 NF nuclei)。
Fig 3a：活化的成纤维细胞主要来自DCM患者P1304和HCM患者P1425。
Fig 3b：这个细胞群高表达已知的活化成纤维细胞基因如 POSTN, NOX4, FAP, COL1A1和COL1A2以及此前没有报道过的基因如family with sequence similarity 155 member A (FAM155A (又称NALF1))和teashirt zinc finger homeobox 2 (TSHZ2)。
作者还根据高表达基因对这群细胞做了染色以证实这群细胞的存在，结果放在supplement。
Fig 3c-e：为了探究这群细胞的来源，作者在这群细胞丰度比较高的两个样品P1304和P1425中做了成纤维细胞的拟时序分析。（slingshot和scVelo做的），可以看到这群细胞确实是静息的成纤维分化来的。
Fig 3f：随后作者使用tradeSeq计算了拟时差异基因，发现一些基因如SLC44A5, COL22A1, POSTN, AEBP1, JAZF1和THBS4延着分化轨迹表达增加。一些基因如NEGR1, PDGFRA, C7, FBLN5和COL4A4则随着分化轨迹出现表达下降。还有一些基因如KCNMA1, HIP1, PRRX1和PRELP在轨迹的不同的stage显示出增加的表达。这个转化是否存在平台期还需要进一步探究。
4. Validation of activated fibroblasts
为了验证这群活化成纤维细胞是否广泛在心肌病患者中存在，作者使用了Myocardial Applied Genomics Network (MAGNet)研究中的DCM, HCM，围产期心肌病和NF的bulk RNAseq测序数据。作者使用自己的数据中的单细胞的细胞群特异表达基因对bulk RNAseq数据进行了反卷积分析，并估计了每个病人样本中活化成纤维细胞的比例。
Fig 3g：在同时具有单细胞和bulk RNAseq数据的34个sample中，4例存在活化的成纤维细胞。而在只有bulk RNAseq数据的样品中，17/155的DCM患者，4/17的HCM患者存在活化的成纤维细胞，NF controls中则都不存在。这些结果进一步证实了活化的成纤维细胞只在心肌病患者中存在。
作者还比较了有和没有活化成纤维细胞的患者的LVEF值，显示没有显著差异。可能是因为样本量比较小。
Fig 3h：作者又在另外两个bulk RNAseq数据集中使用反卷积探究了活化成纤维细胞的存在情况，结论和前面一致。
作者还在患者心脏切片中对这群细胞进行了染色，结果放在supplement。
Fig 3
5. Cardiac fibrosis assay
Fig 4a：最后，作者使用了一个crispr screen去探究TGFβ1刺激下的心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞演变的过程。简单来说，Cas9表达的心脏成纤维细胞被置于384孔板，使用1-4 single guide RNAs (sgRNAs)对前面fig 3f中鉴定出来的27个拟时相关基因分别进行了knock out。(一般针对同一个基因的sgRNA都会设计多个)
这里设计的sgRNA包括：
目标基因的sgRNA（1-4 per gene, n=62）
Non-targeting negative control sgRNA (n=12)
CM-specific negative control gene sgRNA (n=10)
Positive control sgRNA (n=16)
Fig 4b： αSMA是肌成纤维细胞的特征蛋白，也是指征间充质细胞最常用的分子标记之一（Tallquist et al., Nat Rev Cardiol 2017）。和预期的相一致，给予了TGFβ1刺激的心脏成纤维细胞出现了明显的表型转变，出现了SMA的表达。（作者把SMA的表达当作成纤维出现了向肌成纤维转化的特征观测指标）
ACTA2（actin alpha 2）是一种肌动蛋白，有多个别名，包括α-肌动蛋白、α-肌动蛋白-2、主动脉平滑肌或α平滑肌肌动蛋白 (α-SMA)。Actins是球状多功能蛋白质的一个家族，形成微丝。ACTA2是6种不同肌动蛋白亚型之一，参与平滑肌的收缩。ACTA2（和所有actins一样）极其保守，几乎在所有哺乳动物中都有发现。在人类中，ACTA2由位于10q22-q24的ACTA2基因编码。该基因突变导致多种血管疾病，如胸主动脉疾病、冠状动脉疾病、中风、烟雾病和多系统平滑肌功能障碍综合征。ACTA2（α-SMA）目前被认为是肌成纤维细胞的标志。
Fig 4c：作为阳性对照，作者在心脏成纤维细胞中knock out掉了一些已知的参与TGFβ信号通路的基因，包括ACTA2, TGFBR1, TGFBR2, SMAD2和SMAD3。结果显示 ACTA2和TGFBR1的所有的 sgRNAs，3个TGFBR2 sgRNAs其中的2个，都出现了明显的肌成纤维转化下降。SMAD3 sgRNAs也出现了轻微的肌成纤维转化下降。作为阴性对照，作者设计了12个non-targeting control (NTC) sgRNAs和10个靶向5个心肌特异性基因的sgRNAs。12个NTC中的9个和除了1个以外所有的心肌特异性sgRNAs都对TGFβ1 刺激下的成纤维向肌成纤维转化没有影响。而在作者选的27个拟时相关基因中，轨迹中期成纤维的至少1个基因的一个sgRNA和分化轨迹晚期升高的6个基因的sgRNA显示出了明显的肌成纤维生成减少(more than 75%)。
Fig 4d：在前面的7个基因中，PRELP和JAZF1 sgRNA与阳性对照和隐性对照相比出现了明显的SMA的下降。提示他们可以作为心脏纤维化的治疗靶点。
Fig 4
延伸：
肌成纤维细胞是胶原的主要生产者，胶原在正常情况下，负责连接受损组织，成为创伤修复的脚手架。随着修复的开始，肌成纤维细胞和胶原逐渐减少甚至消失。在纤维化疾病中，肌成纤维细胞会持续生产胶原，有时这一过程能被抗炎症药物延缓，但目前治疗纤维化的途径只有器官移植。
为了鉴定肌成纤维细胞的来源，研究人员对小鼠肾纤维化模型进行了研究，他们发现：
• 处于静息状态的成纤维细胞，增殖形成了超过半数的肌成纤维细胞。
• 35%的肌成纤维细胞由间充质干细胞生产，这些来自骨髓的间充质干细胞，先移动到受损位点，然后分化成为肌成纤维细胞。
• 另外10%的肌成纤维细胞，是内皮细胞间充质转换（EndMT）的结果。在这一过程中血管细胞先转变为间充质细胞，然后再形成肌成纤维细胞。
• 最后5%的肌成纤维细胞，来自于上皮细胞间充质转换（EMT）。研究还显示，EMT 和EndMT形成肌成纤维细胞，依赖转化生长因子TGF-B1。
在心血管领域，周斌老师去年发表的一篇circulation报道了使用
EndoMTracer示踪肌成纤维细胞，揭示了在早期胚胎心脏发育中内皮细胞向间充质细胞转变的过程，但成体心脏纤维化中内皮细胞不会发生瞬时EndoMT，也不会形成肌成纤维细胞。而心脏中的成纤维细胞在损伤过程中会被激活，表达间充质基因，并促进损伤区纤维化，提示心脏纤维化的治疗靶点应集中在成纤维细胞。
参考文献：
- Chen, C. Y. et al. Suppression of detyrosinated microtubules improves cardiomyocyte function in human heart failure. Nat. Med. 24, 1225–1233 (2018).
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