研究概述：
结直肠癌是常见的消化道肿瘤，其死亡率和发病率都位居前位。缺氧和大量乳酸产生是CRC微环境的标志。然而，缺氧和乳酸代谢对CRC的影响尚未完全阐明。作者从TCGA和GEO数据库下载CRC的批量RNA测序和临床数据，依据收集的缺氧相关基因（HRGs）和乳酸代谢相关基因（LMRGs），将患者分为3个分子亚型。三个亚型之间呈现出不同的预后结果，其中C1亚型表现出高水平的缺氧，CD8 + T细胞比例低，巨噬细胞比例高。在有严重免疫功能障碍的 C1 患者中，免疫检查点基因的表达通常升高。之后作者构建了一个预测模型，即HLM评分，HLM评分高的患者在免疫微环境中表现出CD8 + 耗竭T细胞的高浸润现象， HLM评分在其他的数据集中也展现出了良好的预测效果。最后，作者利用体外实验证实了，在缺氧条件下，CRC细胞系对5-氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊利替康的敏感性降低。
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研究流程图：
研究结果：
CRC中缺氧相关DEGs（HRDEGs）和乳酸代谢相关DEGs (LMRDEGs) 的鉴定。
作者对从TCGA数据库获得575例CRC样本和51例正常结直肠组织的RNA-seq数据，进行差异表达分析（图2A）。此外，其从MSigDB数据库中检索到326个HRGs和288个LMRGs。然后，作者对患者RNA-seq数据中的所有蛋白质编码基因进行了单因素Cox回归分析，确定了2207个与总生存期（OS）相关的基因。在取DEGs、OS、HRGs和LMRGs相关基因的交集后，作者鉴定出26个缺氧相关DEGs（HRDEGs）和9个乳酸代谢相关DEGs（LMRDEGs）(图2.B-C)。这35个基因的相关性热图 (图2.D)和PPI网络互作图(图2.E)显示，基因之间存在着广泛的相关性和相互作用。
基于HRDEGs和LMRDEGS构建分子亚型差异分析
使用35个交集基因对TCGA数据集中的样本进行重新聚类，发现样本分为三个亚型时，观察到最高的组内平均性（图2.F-G）。综合评估显示不同的分子亚型表现出各异的缺氧和乳酸代谢相关微环境。Kaplan-Meier生存曲线表明，与C2亚型和C3亚型患者相比，C1亚型患者的OS最差。此外，与 C2 相比，C3 亚型的 OS 有更好的趋势（图3.A）。图3.B显示了35个基因在不同亚型中的表达及其与临床特征的相关性。此外，作者评估了结直肠癌共识分子亚型与缺氧和乳酸代谢相关的分子亚型之间的相关性。研究结果显示，C1亚型的CMS4比例较高，而C3的CMS2占主导地位（61.01%，图3C）。GSEA富集分析显示缺氧途径在 C1 中显著上调，相比之下，氧化磷酸化途径显著下调（图3.D），此外，C1 亚型表现出KRAS 信号传导、EMT 和血管生成显着上调（图 3.E）。相比之下，C3亚型中MYC 靶点 v2、MYC 靶标 v1 和 E2F 靶标表现出显著的上调（图 3.F)。
不同分子亚型之间的免疫微环境差别
由于缺氧与免疫微环境密切相关，作者评估了三种亚型的免疫细胞浸润，使用 CIBERSORT 分析了 22 个免疫细胞的浸润，发现 C1 亚型主要含有巨噬细胞，包括 M1 和 M2型。同时，在亚型 C2 和 C3 中观察到 CD8 + T 细胞数量的增加。静息CD4+记忆T细胞、活化的CD4 +记忆T细胞和活化的树突状细胞在C2和C3亚型中的丰度明显高于C1亚型（图4A)。癌症免疫周期（CIC）包含了从癌细胞释放抗原到杀死癌细胞的过程，主要由七个步骤组成。作者发现，C1亚型在癌症抗原的释放、启动和激活、免疫细胞向肿瘤的运输以及免疫细胞浸润到肿瘤中发挥着重要作用（图4B）。图4C 则表明T 细胞、巨噬细胞和 NK 细胞等免疫细胞在 C1 亚型中被广泛招募。作者还评估了三种亚型之间的免疫表型评分（IPS）, C1亚型的IPS显著低于C2和C3亚型（图4.C），表明C1 亚型对免疫治疗的反应较差，具体而言，C1亚型在MHC分子和效应细胞方面表现出较高的分数，而在抑制细胞和检查点方面表现出较低的分数。这些发现似乎与C1亚型相关的不良预后不一致。为了进一步研究这一现象，作者使用TIDE算法分析了样品的免疫功能。结果显示，C1亚型的总体TIDE评分、肿瘤免疫功能障碍评分和肿瘤免疫排斥评分显著高于C2和C3亚型（图4.F），表明免疫逃逸在 C1 亚型中更常见。此外，PD-L1评分（图4.G）和癌症相关成纤维细胞（CAF）评分（图4. H）在C1亚型中显著高于C2和C3亚型。此外，作者还评估了 24 种已知免疫检查点基因在不同亚型中的表达。结果显示，这些分子，包括CD274（PD-L1）、LAG3、CTLA4和CD276
不同亚型的突变图谱和药物敏感性区别
为了更好地理解各种亚型之间的区别，作者在基因突变水平上检查了它们。亚型 C1 和 C2 表现出较高的总突变负荷 （TMB），而亚型 C3 表现出较低的 TMB。临床上，有高危因素的II期结直肠癌患者和III期和IV期结直肠癌患者需要术后化疗，因此作者也利用预测结果，比较了三种亚型患者对最常用的 CRC 化疗药物（即 5-FU、奥沙利铂和伊立替康）的敏感性（图5.D-E）。此外，ssGSEA发现C1的干性富集评分更高，干性相关基因如LGR5和CD34在C1亚型中明显过表达于其他两种亚型（补充图）。干性特征的不同可以解释亚组之间药物敏感性的差异。
体外实验检测结直肠癌细胞在缺氧条件下对化疗药物的敏感性
为了更好地了解肿瘤细胞在缺氧条件下对化疗药物的敏感性，作者进行了体外细胞实验，工作流程如图6A所示。台盼蓝染色显示，在相同浓度的5-FU（7.5μM）、奥沙利铂（7.5μM）或伊立替康（HCT116细胞为10μM，LS174T细胞为50μM）下，与常氧条件下相比，缺氧48 h后肿瘤细胞的存活率更高（图6.B）。CCK8实验证实了这些结果（图6. C-H）。值得注意的是，在缺氧条件下，BAY87-2243 将 HCT116 和 LS174T 细胞对 5-FU 的敏感性提高到常氧水平（图 1）。6C，F）。然而，在常氧和缺氧条件下，HIF-α抑制剂BAY87-2243降低了HCT116细胞对奥沙利铂的敏感性（图6.D)；在常氧条件下的LS174T细胞中也观察到了这一点，在缺氧条件下，BAY87-2243增加了则HCT116和LS174T细胞对伊立替康的敏感性（图6. E-H）。
预后预测模型的构建：
为了阐明缺氧肿瘤的分子机制及其对CRC患者OS的影响，作者比较了预后最差的C1亚型和预后最好的C3亚型之间的差异基因（图7. A）。图7B的热图则显示上调和下调的前 20 个基因的表达水平。KEGG对差异DEGs的分析显示，它们主要富集在细胞粘附分子、ECM-受体相互作用和PI3K-Akt信号通路中（图7. C）。GO功能富集分析显示，这些DEGs在细胞外结构组织、细胞外基质组织、含胶原细胞外基质和细胞外基质结构成分中显著富集，表明DEGs与细胞外基质密切相关（图7. D)。采用单因素Cox回归分析，鉴定出2910个OS相关基因，其中有鉴定830个DEGs与OS相关（图7. E）。随后作者使用RF算法和lasso 回归算法进一步筛选了8个潜在的关键基因（图7.F-H）。
构建模型并验证 HLM 评分的预测有效性
作者基于这8个基因进行了多变量Cox回归分析，获得了6个DEGs来构建预后预测特征，并将其命名为HLM评分（图8. A)。将C1 和 C3 亚型的 251 例患者根据 HLM 评分分为高危组和低危组。随着HLM评分的增加，观察到CRC患者的OS显着降低（图8. B）。Kaplan-Meier曲线显示，高危组患者OS显著较差（图8. C）。ROC预测1年、3年和4年OS的AUC分别为0.78、0.80和0.70，表明具有更好的预测效果（图8. D）。当将HLM评分应用于整个TCGA CRC队列（n = 575）时，C1亚型的HLM评分最高，C3亚型的HLM评分最低，C2亚型的HLM评分中等，与我们之前的分子亚型结果一致（图8. E）。为了更广泛地验证HLM评分的有效性，作者从GEO数据库中获得了三个数据集。这些数据集根据 HLM 评分分为高风险组和低风险组。结果显示，在GSE106584（图8. G)，GSE17536（图8. H）和GSE39582（图8.I）数据集中，高危组患者的OS表现不如低危组患者。此外，IMvigor210免疫治疗队列的数据显示，高危组患者的疾病进展比例较高，完全缓解/部分缓解/疾病稳定的患者较少（图8. J）。Kaplan-Meier 曲线还表明，IMvigor210 队列中高危组患者的 OS 比低危组更差（图8. K）。
ssGSEA和scRNA-seq分析评估免疫细胞浸润
ssGSEA分析结果表明，C1亚型中CD8 + Tex、GZMK + Tex、terminal Tex、OXPHOS-Tex和TCF7 + Tex的富集评分显著高于C2和C3亚型（图9. A）。当根据HLM评分将TCGA CRC样本分为高风险组和低风险组时，也获得了类似的结果（图9. B）。为了进一步验证这些发现，作者分析了公开的scRNA-seq数据（图9. C），根据伪批量分析后各样本的HLM评分，将scRNA-seq数据源的23份CRC样本分为高风险（n=11）和低风险（n=12）组（图9. D-E）。低危组髓样细胞比例略高于高危组（图9. F）。然后，作者对来自这些CRC样品的T细胞进行了亚簇注释（图9. G），高危组中CD8 + T细胞（图9. H）和CD8+上皮内淋巴细胞（补充图）的耗竭比例显著高于低危组。为了确定两组之间CD8 + T细胞比例的具体差异，作者又对CD8 + T细胞进行了进一步的亚群注释（图9. I），结果表明，terminal Tex的比例（图9. J）、OXPHOS-Tex（图9. K）在高危组中显著高于低危组。这些发现表明，HRG 和 LMRG 可能在 CRC 的 CD8 + T 细胞耗竭中发挥作用。
预测列线图的建立以及组成基因在CRC中的功能分析
作者构建了基于年龄、性别、T期、N期、M期、病理类型和HLM评分7个因素的预测列线图，可视化TCGA CRC总队列患者的预后。列线图可以预测C指数为0.78的CRC患者的OS（图10. A）。10基于HLM评分的列线图可以预测CRC患者的短期和长期OS。最后，为了更好地了解HLM评分时如何预测CRC患者地预后，作者对C1和C2亚型的6个基因进行了单基因分析，Kaplan-Meier曲线表明，TRIB2或ELFN2的过表达预示着CRC患者的OS较差（图10. D & G）。山峦图显示了两个基因在CRC病人、正常组织、C1、C2、C3亚型中的表达情况（图10. E & H）。为了获得与 TRIB2 和 ELFN2 相互作用的蛋白质的信息，作者查阅了 BioPlex Interactome 数据库，研究结果表明，与TRIB2相互作用的ISCA1与乳酸代谢密切相关（图10. F）。10同样，与ELFN2相互作用的KLHL24与缺氧密切相关（图10. I）。
研究总结：
总的来说，该篇文章作者根据结直肠癌中差异的缺氧和乳酸代谢基因集，对CRC患者进行分子分型，揭示不同分子亚型下的免疫学和遗传特征。接着作者分析了两个代表性亚型之间的差异表达基因，依靠机器学习算法，，构建了一个HLM评分模型，用于预测CRC患者免疫治疗的预后和疗效。该评分已在多个数据集中得到验证，并有可能指导 CRC 患者的个体化和精确诊断和治疗。
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