细胞支原体检测方法

快捷支原体检测方法

海星生物的支原体检测试服务是使用高灵敏度的PCR检测法，可检测细胞培养物中常见的90多种支原体，检测下限达到10 Copies/mL。

图2   支原体PCR检测数据

哺乳动物细胞支原体污染特征：

在污染的早期阶段，支原体通常不会引起培养基的pH变化，也不会对哺乳动物细胞产生显着的毒性作用。支原体主要生长在哺乳动物细胞膜上。在许多情况下，支原体污染没有明显迹象。但是后续支原体污染的加剧会引起细胞生长速度显著下降、细胞代谢被抑制、核酸合成被抑制、细胞染色体畸变、细胞膜抗原特征变化[4]、并在污染严重后产生很多小黑点，显著改基因转染率和病毒感染效率，影响细胞的基因表达水平。目前支原体污染比较快捷和灵敏的方法就是进行支原体核酸PCR检测。

哺乳动物细胞支原体污染途径：

支原体污染方式是支原体感染细胞与未感染细胞系的交叉污染发生的。该途径主要是移液过程中产生的气溶胶在公用超净台发生交叉污染，所以在工作流程中，需要始终注意“从干净到污染”的处理细胞流程。首先处理未受污染的细胞，其次是未知或未检测的细胞，最后是疑似或已知受污染的细胞。受污染细胞都不应该在在实验室中保留，包括液氮罐[5]。再有就是80%的实验室技术人员是支原体携带者，支原体污染可以通过一个喷嚏甚至说话间发生污染，所以必须做好人员的防护。

哺乳动物细胞支原体污染预防：

l 实验人员始终穿戴个人防护装备：包括消毒的实验外套、手套（经常更换或消毒），佩戴口罩。

l 严格控制细胞来源，务必从能够提供准确PCR检测的细胞库获取细胞。支原体能在液氮中存活，因此在将新细胞需先隔离存放，待检测合格后再放入液氮罐。

l 良好的无菌操作，必须注意液体操作过程中培养基滴漏并迅速清洁任何滴落的液体，及时更换移液器吸头并避免在细胞操作区域说话等会有气溶胶产生的行为。

保持整个实验室空间清洁。细胞操作区应移除无关物品包括纸皮箱等，并每周进行消毒。

支原体污染的危害

支原体是实验室中常见的污染细胞的原核生物，据统计约有15%-35%的细胞被支原体污染。支原体会改变宿主细胞的结构和功能等一系列特征，造成实验结果不正确；干扰细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞抗原性，导致染色体改变，干扰病毒复制以及模仿病毒的作用。因此，每一株外来细胞在进入实验室之前，都应进行支原体检测，并且应对培养中的细胞定期（如每2-3个月）进行支原体检测。

建立定期的监控方案，有助于提高科研效率，在污染发生在早期时及时处理。可避免支原体污染造成更大的损失！

体外培养环境中，细胞自身没有抗污染的能力，即使培养基会添加抗生素，抵抗污染的能力也很有限。常见的微生物污染为细菌、真菌、支原体和病毒等，其中又以支原体污染最为普遍棘手。一旦污染了支原体的细胞将无法正常形成单克隆，而且细胞转染过程容易死亡，细胞实验效率极低。为了维持实验的稳定，必须对所有的实验使用到的细胞进行支原体的检测。

支原体污染后，细胞不会有明显的死亡现象，且支原体通常能与细胞长期共存，培养体系亦无浑浊现象，然而实际上却可能存在细胞形变，DNA合成受抑制等诸多问题，并且即使发现支原体污染也较难彻底清除，因此确保细胞在实验初期无微生物污染是至关重要的。

采用PCR法对目的细胞进行细菌、真菌和支原体等检测。以微生物16（18）SrRNA基因为靶基因，设计通用引物并建立PCR扩增体系。

如常用的两个针对16S rRNA基因的通用引物对为27F, 1492R和63F, 1387R。

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'

63F：5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’；1387R：5’-GGGCGGTGTACAAGGC-3’

细胞样品为PCR阳性，将PCR产物送测序，经BLAST比对为牛支原体

研究调查表明，约有20多种支原体能污染细胞（尤其是传代细胞），95%以上是牛源性，常见为口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.Hyorhinis）和菜氏无胆甾原体（A.laidlawii）。

通用的快速基因诊断技术，经大量实验证实，能保证所选引物具有良好的保守性和特异性，重复性好且操作简单，相较于传统的微生物培养法，能有效地缩短实验周期至3天，达到快速反馈检测结果的目的。

HyCyte™ 支原体清除试剂用于清除受感染细胞培养中的支原体，经验证，可有效去除莱氏无胆甾原体（Acholeplasma laidlawii）、精氨酸支原体（Mycoplasma arginini）、猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）和口腔支原体（Mycoplasma orale）等支原体。在动物细胞培养中，这些支原体菌株占污染的 85%以上。

HyCyte™ 支原体清除试剂对培养细胞没有细胞毒性副作用，不影响后续细胞实验。

HyCyte™ 支原体清除试剂使用简单，按使用方法直接添加至完全培养基中即可。

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