支原体的检测方法有哪些？

如何选择正确的方法进行细胞的支原体检测？支原体的检测方法有哪些？目前实验室常用的支原体检测方法有培养法、荧光指示细胞法、PCR 法、扫描电子显微镜法，这些方法各有优缺点。各实验室可根据具体情况，选择不同的方法，或几种方法联合使用。

一、培养法

培养法为最为经济可靠的方法，但其实验周期较长，所以常用来进行对怀疑细胞的最后甄别。常用于细胞及临床治疗细胞的支原体检查。

（一）材料与设备

1. 精氨酸肉汤培养基   按说明称量粉剂，蒸馏水配制， 高压除菌（加20％胎牛血清）。

2. 支原体琼脂培养基   按说明称量粉剂，蒸馏水配制，高压除菌（加20％胎牛血清）。

3. 其他   超净工作台、无菌吸管、试管架、培养试管／皿、37°C 培养箱。

（二）操作步骤

1. 样品的储存。样品取材后，最好尽快进行检测。样品如在24h 以内进行支原体检测， 可储存在2~8℃; 如果超过24h 样品应放置于－20℃ 以下保存。-20℃保存的样品，进行检测时需重新加入到对照培养细胞中，培养72h 后，取上清直接进行接种检测。

2. 准备精氨酸肉汤培养基、支原体琼脂培养基（半流体）。

3. 将样品分别接种到10ml 精氨酸肉汤培养基、半流体培养基中（已冷却至36℃） ，每支培养基接种样品0.5~ 1.0ml. 每种样品接种6 支精氨酸肉汤培养基，3 支半流体培养基。

4. 接种6d 后，取3 支精氨酸肉汤培养基中样品0.5 ~ 1.0ml. 复种于精氨酸肉汤培养基中。

5. 36 ℃ 培养29d, 每隔3d 观察一次。记录实验结果。

（三）结果判断

培养结束时，精氨酸肉汤培养基如有支原体生长，则液体颜色改变（粉色或黄色) 。

半流体培养基中如有支原体生长，则出现絮状沉淀

二、荧光指示细胞法 

荧光指示细胞法较为快捷，方法简单，但其灵敏度有一定的欠缺， 易造成漏检。

常见的支原体检测方法中最简单、最经济的方法是荧光指示细胞法。该方法使用的荧光染料是烟酸己可碱，其激发波长为350nm（紫外激发），发射波长为420nm。该染料会结合到DNA 中富含A-T 的区域，由于支原体的DNA中A-T 含量占多数(55%~80%），所以可被染色而检测到。支原体污染的细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体DNA, 证明该细胞有支原体污染。

（一）材料与设备

1. 荧光显微镜。

2. CO2 培养箱。

3. 无菌小爬片。

4. 无菌培养皿。

5. 不含抗生素的完全培养液。

6. 二苯甲酰胺荧光染料浓缩液(50μg/ml) 。称取5mg 二苯甲酰胺荧光染料加入100ml 不含酚红和碳酸氢钠的Hanks 平衡盐溶液中，在室溫下用磁力搅拌30~40min, 使完全溶解，－20℃ 避光保存。

7. 二苯甲酰胺荧光染料工作液(0.5μg/ml) 。取1ml 上述浓缩液，加至100ml 无酚红和碳酸氢钠的Hanks 溶液中，终浓度为0.5μg/ml 。

8. 固定液，即乙酸：甲醇(1 : 3) 溶液为细胞固定液。

9. 封片液。0.1mol/L枸橼酸22.2ml, 0.2mol/L Na2HPO4·12H2O 27.8ml, 丙三醇50.0ml，以上三者混匀，调pH 至5.5 。

10.不含酚红和碳酸氢钠的Hanks 平衡盐溶液或PBS。经多种方法检测确定为支原体阴性的VERO 细胞。

（二）操作步骤

1. 无菌收集待测细胞上清：悬浮细胞离心后取上清液。

2. VERO 细胞爬片：将小爬片无菌置于小培养皿内，滴加VERO 细胞悬液(细胞浓度约3×104 个/ml) 2~3ml, 置于CO2 培养箱内培养24h 使其贴壁。

3. 制备标本。向6 孔板内滴加待检细胞上清液约1ml, 注意设立对照组（已证实的支原体阳性和阴性细胞上清液），培养48h 后( VERO 细胞汇合前）将细胞爬片从平皿中取出。

4. 漂洗—将细胞爬片置于培养皿中，用不含酚红、NaHCO3 的Hanks 溶液（或PBS) 漂洗3次。

5. 固定—用乙酸：甲醇(1 : 3) 固定液固定 10 min 。

6. 漂洗—待固定液自然风干后用去离子水漂洗3 次。

7. 染色—置于Hoechst 33258 工作液(0.5μg/ml) 中染色10 min 。

8. 漂洗—去离子水中漂洗3 次，每次1 ~2min 。

9. 封片，紫外激发，观察。

（三）结果判断

当阴性及阳性对照结果均成立时，结果有效 。

1. 阴性结果 仅见待检细胞的细胞核呈现蓝色荧光。

2. 阳性结果 荧光显微镜下细胞周围或细胞膜表面可见大小不等、不规则的蓝色荧光小点和丝状点。

（四）小结

1. 严格配制工作液及封片液。

2. 保证作为指示细胞的VERO 细胞没有被支原体污染。

3. 必须同时设立阳性及阴性对照， 注意重复，以排除假阳性和假阴性结果。4. 应全面观察爬片，并注意可疑阳性的荧光点是凋亡小体还是支原体污染。

5. 可适当调整荧光染料的工作浓度和染色时间，避免出现非特异性染色，如胞浆着色。

三、PCR 法  

PCR 法检测支原体的方法最为快速、灵敏、取样量少，既可做细胞本身，也可做细胞上清的检测，同时可以检测多种支原体的污染，是目前常用的检测手段。但其成本较高，条件要求严格，且有时易出现假阳性或假阴性。弥补的方法是对怀疑的样品要经过3 次PCR 检测，或用培养法检测。

PCR 法是20 世纪80 年代中期建立起来的一种体外DNA 扩增实验，其基本原理是酶促DNA 合成反应，即在DNA 模板、引物和脱氧核糖核酸存在下，经DNA 聚合酶的作用，使DNA 链扩增延伸。该实验具有灵敏度高、特异性强、检测快速的特点，但其对实验环境要求严格， 实验成本较高， 有时还会出现假阳性的现象。

（一）材料与设备支原体

PCR 检测试剂盒、dNTP 、TaqDNA 聚合酶、缓冲溶液、琼脂糖、矿物油、超净工作台、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、台式离心机、旋涡混旋器等。

（二）操作步骤

1. 样品的收集。待测细胞用无双抗培养液培养7d，用无菌容器取上清液500μl ,4℃ 保存待测。

2. 模板的制作。在无菌的条件下， 取细胞培养上清1 00μl 于一无菌的0.5ml塑料离心管内，盖好盖子， 95 ℃ 水浴加热5min 。

3. 打开盖子，向管内加StrataClean Resin 10μl，盖好盖子，旋涡混悬器混合，离心5~ 10s, 吸取上清至一新的塑料离心管中，模板制作完毕， 4℃ 保存。

4. PCR 反应。反应体系的最适条件为10mmol/L Tris-HCI (pH 8.38), 50 mmol/L KCI, 1.5~ 2.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP, 2U Taq DNA 聚合酶，总反应体系为50μl ， 反应用去离子水均需用紫外灯照射。

（1）在0.5ml 塑料离心管中加入35.2μl 去离子水及5μl 10 xTaq 反应缓冲溶液。

（2）依次加入下列成分：0.4μl dNTP (25mmol/L）、0.4μl Taq 酶(5U/μl ) 、2μl引物。

（3）加2μl 去离子水，总体积45μl 。

（4）加5μl 已制成的模板到反应体系中。

（5）阳性对照，内对照各5μl 加入到各自的反应体系中。

（6）取1支含有以上反应体系的离心管，加入5μl 去离子水作为阴性对照管。

（7）在反应体系中加入100μl 矿物油。

（8）PCR 程序见下表。

5. 琼脂糖凝胶电泳。PCR 反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为2%。电泳结束后，凝胶成像分析结果。6. 结果分析。该方法为检测支原体的定性方法，在电泳泳道上， Marker、阳性对照、内对照均会出现不同的电泳条带， 当被检样品泳道出现明亮条带，且位置在阳性对照和内对照条带位置之间，即可认为该样品被支原体污染 。

有时还会发现一条泳道出现多条，可能是该样品感染2 种以上支原体所致。如果泳道内条带隐约出现，则可怀疑有支原体污染，重做该样品。

（三）注意事项PCR 反应的前期操作应在无菌环境中进行。注意假阳性、假阴性，有时需多次重复。 

四、扫描电子显微镜法 

扫描电子显微镜法：扫描电子显微镜法非常直观、准确，对使用环境要求高，操作复杂，实验周期较长，常作为样品的最后定性检测。

（一）原理

利用电子显微镜的超级放大功能， 直接观察培养细胞中支原体污染情况。

（二）材料与设备

待检测细胞， 0.05％胰蛋白酶／0.02%EDTA 、2.5％的戊二酸、1％锇酸、0.1mol/L磷酸缓冲溶液（ pH7.4 ) ，扫描电镜及相关设备。

（ 三）操作步骤

1. 将待检测细胞传代至贴有盖玻片的培养皿中。

2. 37°C , CO2 培养箱中培养24h , 取出盖玻片。

3. 以PBS 洗涤3 次。

4 . 以2 .5％戊二醛/PBS 固定15min , PBS 洗涤。

5 ．以1％锇酸固定30min, PBS 洗涤。

6 . 乙酸异戊酯脱水。

7. CO2 冰点干燥。

8. 喷金。

9 . 扫描电镜观察，照相。

（四）结果分析

支原体感染会使培养细胞慢慢枯萎，因此对培养细胞定期进行支原体检测非常重要。一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。将定期支原体检测常规化坚持下去，是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。