一、小RNA基础概述
1. 小RNA基础
1.1 小RNA是指在生物体中表达的， 不编码蛋白， 长度较短（1 8~30nt或40nt） 的RNA分子， 参与诱导基因沉默， 参与细胞生长、 发育、 基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。
1.2 microRNA， 简称miRNA， 是目前功能研究较为透彻的一类小RNA(20~25nt)。 miRNA通过与特定mRNA的结合调节相应基因的表达， 这些基因称为该mRNA的靶基因。
2.调控作用
miRNA调控作用, A为剪切调控多见于植物；B为抑制调控多见于动物
3. 适用范围
3.1 模式物种， 有参考基因组， miRNA数据库注释较多， 找出新miRNA， 研究miRNA的功能。
3.2 非模式物种， 无参考基因组， miRNA数据库注释较少， 研究物种中存在的与其他物种同源的miRNA。
二、小RNA测序流程
1. 小RNA测序技术简介
1.1 小RNA测序技术采用胶分离技术， 收集样品中1 8-30nt或1 8-40nt的RNA片段， 利用高通量测序技术， 一次性获得单碱基分辨率的数百万条小RNA序列信息， 依托强大的生物信息分析平台， 鉴定已知小RNA， 并预测新的小RNA及其靶标。
1.2 小分子RNA是生物体内一类重要的特殊分子， 诱导基因沉默， 参与细胞生长、 发育、 基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。
2. 样品要求
样品类型： 完整且无污染的总RNA；
样品需求量（单次） ： ≥ 10 μg；
样品浓度： ≥ 200 ng/μl；
样品纯度： OD 260/280 = 1 .8~2.2、 OD 260/230 ≥ 2.0、 28S:18S≥ 1.5、RIN≥ 8.0、 23S:16S≥ 1.5(此项要求只针对原核生物)；
提取总RNA时请不要使用Qiagen等公司的过柱试剂盒， 也不要使用LiCl沉淀；
如果是使用mirVana™ miRNA Isolation Kit等试剂盒回收的< 200 nt的Small RNA（无法判断RNA的完整性） ， 测序请提供浓度≥ 20 ng/µl、总量≥ 1 μg的RNA样品。
3. 小RNA测序建库流程
三、小RNA分析流程
1. 小RNA信息分析流程图
2. 小RNA测序信息分析内容
• 1 . 数据产出统计， 对原始测序数据去接头， 去低质量， 去污染
• 2. 1 8~30 nt small RNA 的长度分布
• 3. 样品间的公共序列和特异序列的分析
• 4. Small RNA碱基偏好性分析
• 5. Small RNA 在选定的参考基因组上的分布（只能选定一个参考基因组）
• 6. Small RNA 与rRNA、 tRNA、 snRNA、 snoRNA的比对信息
• 7. Small RNA 与重复序列的比对信息（需提供选定参考基因组对应的重复序列注释信息）
• 8. Small RNA 与 exon/intron 的比对信息(需提供选定参考基因组对应的基因注释信息)
• 9. Small RNA 与 miRBase 中指定范围的已知的 miRNA 的比对
• 10. 按照优先级将 small RNA 进行分类注释
• 11 . 未注释的small RNA 预测， 预测新的miRNA， 绘制新miRNA的二级结构图
• 12. 已知miRNA 的表达量统计
• 13. 已知miRNA 的家族分析（需要提供参考物种拉丁文名称）
• 1 4. 样品间miRNA差异分析（2个或2个以上样品） 和聚类分析（3个或3个以上样品）
• 1 5. MiRNA靶基因预测（需要提供基因编码序列， 可选择多做预测算法）
• 1 6. MiRNA靶基因GO注释和KEGG通路分析
• 1 7. MiRNA的碱基编辑分析（已知miRNA）
• 1 8. 差异MiRNA靶基因预测
• 1 9. 差异MiRNA靶基因GO注释和KEGG通路富集分析
注：此处14-19条miRNA包括已知的miRNA和预测出的新的miRNA
3. 测序结果的过滤
1. 过滤低质量的数据：low quality cutoff：30；the percent cutoff of good quality base：0.85
2. 过滤N的碱基：the percent cutoff of unknown base：0.1
3. 去除3’接头序列；
4. 长度过滤大于30小于18nt的序列；
5. 含有polyA的序列；
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