前不久看到一篇发表在 Cell Reports 抗病毒和m6A相关的文章
Post-transcriptional regulation of antiviral gene expression by N6-methyladenosine
- 通讯作者是 Stacy M. Horner ，杜克大学医学中心的分子遗传学和微生物学助理教授
文章里有几个图挺好看的，图注是 Read coverage plots ，红色线代表 IP ，黑色代表 Input ，线周围都有各自颜色的区间代表生物学重复的方差，黄色区间是鉴定到的 m6A peak 区域。
image
尝试以下模仿这种类似的图行用 ggplot2 绘制一个。
假如有四个比对排序好的 bam 文件四个，[ Input1、Input2、IP1、IP2 ] 。( bam文件是比对到转录组序列上的 )
- 首先获得每个 bam 的测序深度
# 生成的文件比较大，-a 参数表示输入每个位置的测序深度
$ samtools depth -a Input1.bam Input2.bam IP1.bam IP2.bam > test_depth.txt
# 查看生成的文件内容
$ less test.txt
NUDT4_ENSG00000173598_ENST00000337179_440_983_9753 1 0 0 0 0
NUDT4_ENSG00000173598_ENST00000337179_440_983_9753 2 0 0 0 0
NUDT4_ENSG00000173598_ENST00000337179_440_983_9753 3 0 0 0 0
第一列：[基因名[-[gene id]-[transcript id]-[cds_start]-[cds_stop]
第二列：转录本位置
第三列至第五列：各个 bam 文件的测序 depth
- 随便挑选个 METTL3 基因出来画
$ grep 'METTL3' test_depth.txt > mettl3_depth.txt
$ less
METTL3_ENSG00000165819_ENST00000298717_117_1857_1980 1 0 0 1 2
METTL3_ENSG00000165819_ENST00000298717_117_1857_1980 2 0 0 5 3
METTL3_ENSG00000165819_ENST00000298717_117_1857_1980 3 0 0 9 4
step1、接下来在 Rstudio 里操作
# 读入数据
mettl3_depth <- read.delim("C:/Users/admin/Desktop/mettl3_depth.txt", header=FALSE)
# 取出 input 和 ip 组
input <- mettl3_depth[,c(1,2,3,4)]
ip <- mettl3_depth[,c(1,2,5,6)]
# 计算均值和标准差
input$mean <- apply(input[,c(3,4)], 1, mean)
input$sd <- apply(input[,c(3,4)], 1, sd)
input$samp <- 'Input'
ip$mean <- apply(ip[,c(3,4)], 1, mean)
ip$sd <- apply(ip[,c(3,4)], 1, sd)
ip$samp <- 'Ip'
colnames(ip)[3:4] <- c('V3','V4')
# 合并
p_dat <- rbind(ip,input)
# 查看最后合并后的数据
head(p_dat)
V1 V2 V3 V4 mean sd samp
1 METTL3_ENSG00000165819_ENST00000298717_117_1857_1980 1 1 2 1.5 0.7071068 Ip
2 METTL3_ENSG00000165819_ENST00000298717_117_1857_1980 2 5 3 4.0 1.4142136 Ip
3 METTL3_ENSG00000165819_ENST00000298717_117_1857_1980 3 9 4 6.5 3.5355339 Ip
4 METTL3_ENSG00000165819_ENST00000298717_117_1857_1980 4 9 5 7.0 2.8284271 Ip
5 METTL3_ENSG00000165819_ENST00000298717_117_1857_1980 5 9 6 7.5 2.1213203 Ip
6 METTL3_ENSG00000165819_ENST00000298717_117_1857_1980 6 9 6 7.5 2.1213203 Ip
step2、准备好数据后可以绘图了
# 加载需要的R包
library(ggplot2)
library(ggprism)
# 绘图
p1 <- ggplot(p_dat,aes(x=V2,y=mean)) +
geom_rect(aes(xmin=117,ymin=-Inf,xmax=1857,ymax=Inf),fill='grey95',alpha=.35) +
geom_line(aes(color=samp),size=1) +
theme_prism(border = T,base_size = 16,base_line_size=1) +
xlab('') + ylab('Read Coverage') +
labs(title = 'MeRIP-seq read Distribution') +
#主题细节调整
theme(axis.title.y = element_text(size = 18),
plot.title = element_text(,hjust = .5,size = 18),
legend.position = c(0.1,0.9),
legend.background = element_blank(),
legend.text = element_text(size = 14,face = 'bold'),
legend.key.width = unit(1.5,'cm'),
legend.key.height = unit(1,'cm')) +
# 给线添加方差区间
geom_ribbon(aes(ymin=mean - sd,ymax=mean + sd,fill=samp),alpha=.3,show.legend = F) +
# 调整颜色
scale_color_manual(values = c('black','red')) +
scale_fill_manual(values = c('black','red')) +
# 添加黄色高亮区域（文章里应该是m6a存在的peak区域），我这随便选两个
geom_rect(aes(xmin=650,ymin=-Inf,xmax=750,ymax=Inf),fill='yellow',alpha=.002) +
geom_rect(aes(xmin=1400,ymin=-Inf,xmax=1600,ymax=Inf),fill='yellow',alpha=.002)
p1
image
step3、接下来转录本的结构怎么画呢？这里还是使用 geom_rect 函数
# 绘制转录本结构图
p2 <- ggplot(p_dat,aes(x=V2,y=mean)) +
# 绘制 5UTR 区
geom_rect(aes(xmin=0,ymin=0.05,xmax=117,ymax=0.1),fill='grey50') +
# 绘制 CDS 区
geom_rect(aes(xmin=117,ymin=0.025,xmax=1857,ymax=0.125),fill='grey50') +
# 绘制 3UTR 区
geom_rect(aes(xmin=1857,ymin=0.05,xmax=1980,ymax=0.1),fill='grey50') +
# 主题细节调整
theme_classic() + xlab('METTL3') + ylab('') +
theme_prism(border = F,base_size = 16) +
scale_y_continuous(limits = c(0,0.2)) +
theme(axis.line = element_line(colour = 'white'),
axis.text = element_text(colour = 'white'),
axis.title.x = element_text(face = 'italic',vjust = 10),
axis.ticks = element_line(colour = 'white')) +
# 添加注释标签
geom_text(aes(label="5'UTR",x=117/2,y=0.17),size=4) +
geom_text(aes(label="CDS",x=(1857-117)/2 + 117,y=0.17),size=4) +
geom_text(aes(label="3'UTR",x=(1980-1857)/2 + 1857,y=0.17),size=4)
p2
image
step4、拼图
# 加载拼图的包
library(patchwork)
p1 + p2 + plot_layout(ncol = 1, heights = c(8, 1))
image
emmm...，是不是有那个味道了，后续再 Ai 里稍微修一下就行了。
绘图后记
阅读这篇文献的 STAR METHODS 部分，发现作者绘图用的是一个 CovFuzze 的 python 脚本做的
image
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githup 网址 ：https://github.com/al-mcintyre/CovFuzze
安装方法：
$ pip install covfuzze
用法介绍：
# required arguments:
-o OUT, --out OUT output prefix (incl. dir)
--bams BAMS [BAMS ...]
bam files (separated by spaces)
--bed BED bed file for region(s) of interest
-l LABELS [LABELS ...], --labels LABELS [LABELS ...]
labels associated with bams - if replicates, use same
labels
# optional arguments:
-h, --help show this help message and exit
-g GENE, --gene GENE gene name (default = GeneDoe)
--gtf GTF gtf file for gene to plot cds as shaded regions separated by exon
-p PEAKS, --peaks PEAKS
bed file with peaks
-n NSUBPLOTS, --nsubplots NSUBPLOTS
number of subplots- bams will be split evenly based on
the order given (default = 1)
--normalize normalize by gene length/summed coverage (default = False)
--scale scale y axis separately for each subplot (default = False)
用法示例：
$ covfuzze -o ./zikvtest --bams zikv_test1.bam zikv_test2.bam --bed zikvPR.bed -l input input --gene zikvPR -n 1
出来的图是这样的
image
我研究了以下并不是很懂他这个画图的具体原理是什么，应该是根据比对到基因组上的 bam 文件，使用提供的 bed 位置信息计数再画图，暂时还不知道这个脚本怎么把5UTR、CDS、3UTR分别计数再合并起来统计绘图的，此外一个基因含有多个转录本，这个怎么处理呢？
大家可以去尝试一下。
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