关于近红外荧光探针（IRB-NHS）检测试剂盒的常见问题解答

关于近红外荧光探针（IRB-NHS）检测试剂盒的常见问题解答

[if !supportLists]1.    [endif]投量一般是按摩尔数比来算的，大概是需要接入氨基的个数的2倍投量。用这个方法换算的话，因为不知道 IRB-NHS 里面含有几个活性酯，所以具体的量无法确定。

答复：每个IRB-NHS中只有一个活性酯，但由于IRB-NHS本身水解作用，其投料比往往控制在伯氨基的1.5-2.0倍左右。

[if !supportLists]2.    [endif]标记抗体时，抗体与染料的投料比是多少？

答复：是1:3（摩尔比），大概每个抗体上可以标记1个左右荧光基团。

[if !supportLists]3.    [endif]想用这个染料修饰的材料的分子结构式中含有氨基（伯胺）和羧基，有两个问题：

[if !supportLists]1)    [endif]羧基会不会参与反应？如果会的话我需要如何处理？

答复：羧基不会参加反应，IRB-NHS只与待标记材料中的伯氨基反应生成稳定的酰胺键。

[if !supportLists]2)    [endif]这种染料在与伯胺反应后，水溶性如何，还会有何种水溶性基团。

答复：荧光基团本身含两个磺酸基，其水溶性很好，不会现在改变所标记材料的水溶性。

[if !supportLists]4.    [endif]该染料的分子结构信息，可否提供？

答复：母核是花菁类染料，可以提供其基本结构。

[if !supportLists]5.    [endif]关于“配制的DMF稀释液需立即使用。存放导致活性迅速丧失”这个说明，染料标记上靶分子以后，荧光可以持续多久？

答复：活性丧失主要是指活性NHS酯基基团破坏，无法与待标记材料商氨基键合，并非指荧光信号本身消失。连接上目标材料后，低温避光保存，固体状态荧光可以维持数月，液体状态数周。

[if !supportLists]6.    [endif]有一个实验方案如下：标记的是一个多肽，共61个氨基酸，大小为6.6KD。

[if !supportLists]1)    [endif]多肽溶于无菌PBS中，终浓度为10 mg/ml。

[if !supportLists]2)    [endif]将0.2mg IRB-NHS 粉末配置成  DMSO 溶液( 0.01 mg/uL)。

[if !supportLists]3)    [endif]将配置好的20ul染料立即逐滴分别滴加至200ul 10mg/ml 多肽溶液中，至于摇床，室温反应2 h。

[if !supportLists]4)    [endif]反应结束后，反应液加入超滤管中进行超滤（ 4000 rpm，30×3min ）取超滤管上层溶液。

[if !supportLists]5)    [endif]尾静脉注射SCID小鼠，100ul IRB-NHS-V5/mice

   请问这个方案合理吗？

答复：该方案基本合理。反应环境pH可以控制在7.4-8.3之间。IRB-NHS使用量（摩尔数）应为根据每条多肽期望的荧光基团个数的两倍量。另要确保多肽上有足够的伯胺基可以与NHS活性酯反应。另外，尽量避免多肽上功能区域的胺基与荧光基团反应从而影响多肽活性。反应结束后，建议纯化后观察材料颜色。成功标记后的材料应该呈深绿色。

[if !supportLists]7.    [endif]抗肿瘤抗体，190KD，想做近红外靶向成像实验，抗体和染料的比例是多少？在尾静脉100ul情况下打入的抗体应该控制到多少摩尔，多少质量会有比较好的成像效果？感觉最重要的环节就是比例和用量，不然小分子多的话靶向性真的体现不好，其他代谢部位都有扩散。

答复：一般每个抗体上标记2-5个近红外荧光分子就能够很好进行成像。抗体注射剂量与诊断和治疗目标有关，有很多文献可以查到！标记到抗体上的荧光基团由于数量很少，不会对抗体靶向性产生影响！

[if !supportLists]8.    [endif]激发波长对实验结果影响多大？有的仪器没有789nm的波长？

答复：最佳条件是在探针最大吸收处激发，但在730-780 nm处激发都有较强信号！

[if !supportLists]9.    [endif]感觉这个固体粉末是不时间稍久就会沾到管壁上，上次做的时候，用的是实验室师兄以前买的，但都沾到了管壁上，不能够实际称量，我就用DMSO溶解了，但感觉比例就加的不对了，染料可能加多了，胃肠处的荧光强度太强，都曝红曝白了

答复：活体注射是要摸索剂量的。该探针由于含有NHS基团，不宜长期存放，建议购买后3个月内使用！不能配成溶液后存放!

[if !supportLists]10. [endif]在染料和抗体偶联完后，三次超滤后仍见超滤下来的液体是绿色，是否为染料加入过多？是否要超滤到无色为止？

答复：最好超滤液中不要有明显绿色！但也有可能是滤膜不好导致抗体滤出导致颜色。

[if !supportLists]11. [endif]如果多肽分子量太小，1.5KD 用什么纯化方法比较好？可以用HPLC纯化吗？

答复：一般利用层析柱分析。根据分子量差异进行分离。探针分子量为800，所以很容易进行分离。

[if !supportLists]12. [endif]多肽是1400，不好分啊？cy5.5可以用HPLC不知道你们的这个可以不？HPLC对偶联后的多肽和IR影响大吗？

答复：1400和标记荧光基团后的2200还是可以用层析住分的。分子量还是差别较大的。也可以用HPLC分。不过更耗时一些。

[if !supportLists]13. [endif]1.4KD的多肽和IR783耦连后，如何把多余的IR783去除掉？具体一点的方法。

答复：利用标记前后分子量不同可以通过柱层析分离。

[if !supportLists]14. [endif]举个例子吧，如果我有一个多肽抗体，32KD，配制成2mg/ml的溶液与IRB-NHS结合，按1只小鼠的量，那我需要多少IRB-NHS，配制成多少量？

答复：探针标记剂量与抗体注射剂量有关，一般而言，每个抗体上标记2-3个探针就能够产生足够强的信号！根据需要注射抗体摩尔数就可以计算出需要标记多少探针！

[if !supportLists]15.[endif]反应好的溶液进行超滤，体积会减少，那最后需要保证多少体积？

答复：一般而言，纯化后的探针标记抗体保留在100-200微升PBS母液中，根据每只小鼠注射200微升体积进行稀释和注射！