文献
2023
Genome Biology
Dynamic chromatin regulatory programs during embryogenesis of hexaploid wheat
课题背景
（1）胚胎发生是指配子融合后产生一个新的有机体，它代表的发育的开始。在哺乳动物中，已经利用全基因组染色质分析技术进行了早期胚胎发育过程的时间序列表观调控分析，这些开创性研究揭示了表观遗传重塑在胚胎发育中的重要作用。表观调控伴随了哺乳动物早期胚胎发生过程的一系列事件，包括母源-合子转换（MZT）、合子基因组激活（ZGA）、谱系特化和命运决定，以及组织命运分化。在以上过程中，组蛋白修饰经历了广泛的重塑，表现出保守和特异性的模式。
（2）在植物领域，尤其是对于复杂基因组的作物，对于表观遗传动态的了解仍然大部分未知。对比植物和动物的胚胎发育过程能找到一些共性和差异。植物和动物共享一种通用的细胞分化策略，细胞命运的决定伴随着胚胎细胞分裂。此外，两者的转录程序都遵循相同的“沙漏模型”，同一门类下的物种在胚胎发育在早期和晚期表现出转录的差异，而在中期相似。与此相反，不同门类下的物种在胚胎发育早期和晚期相似，而中期存在差异。
（3）小麦是一种重要的粮食作物，由于其基因组倍性复杂，利用小麦作为模型阐明多倍体胚胎发育过程的基因组和表观组调控更具有重大意义。六倍体小麦（AABBDD）源自三种可能的二倍体野生草本祖先物种的两次杂交和多倍化事件。有研究对多倍体小麦和二倍体祖先在胚胎发育期间的转录组进行了定位，揭示了基因表达的进化分歧以及A、B和D亚基因组对谷物发育的贡献。
亮点
对小麦而言，表观遗传及其转录调控能力对细胞命运转变的贡献仍需阐明。为填补这一空白，作者对六倍体小麦胚胎发育的八个典型阶段中绘制了转录组和表观遗传图谱，用于研究胚胎发育过程六倍体基因组的表观遗传调控。
结论1 小麦胚胎发育过程表观图谱
Fig 1a-d
作者对开花后0，2，4，6，8，12，16，22天进行了7种组蛋白修饰以及H2A.Z的CUT&TAG测序、ATAC-seq以及转录组测序（Fig 1a）。转录组包含三个生物学重复，其他数据各两个生物学重复。
植物胚胎发育通常分为三个阶段：
（1）胚胎发育早期，在此期间受精后形成了一种全能的合子；
（2）胚胎发育中期，在此期间建立了主要的细胞谱系和体型模式
（3）胚胎发育晚期，在此期间成熟胚胎积累养分，随后进入种子休眠期。
Fig 1e-f
RNA-seq和ATAC-seq在主成分分析种展示出一个连续的轨迹（Fig 1b, e），而组蛋白修饰展示出一个具有明显阶段性转换的模式。
GO富集显示，DNA复制相关功能在胚胎发育的早期被富集，与器官/组织分化相关的基因在胚胎发育中期被富集，而养分积累和休眠相关的基因在胚胎发育晚期被富集（Fig 1c）。
已知的与胚胎发育相关的基因，如WOX11、LEC2、ARR6和ABI5，在小麦、短柄草和拟南芥之间显示出保守的表达模式，但是其他基因，如YUC1，则没有保守模式（Fig 1d），这说明了单双子叶植物胚胎发育过程的异同。
DPA8是命运转变的关键阶段，在此之前染色质可及性逐渐积累，此阶段之后逐渐下降（Fig 1f）。值得注意的是，大部分染色质可及性的峰距离TSS上游较远（Fig 1g），与小基因组物种相比，这一距离明显更远。
综上所示，作者构建了六倍体小麦胚胎发育过程完整的表观组、转录组和染色质可及性图谱。组蛋白修饰和染色质可及性与基因转录的一致性变化有助于阐明小麦胚发生中多种调控事件的表观遗传基础。
结论2 明显的近端和远端染色质可及性的动态变化
Fig 2a-b
对于ATAC-seq数据，作者共鉴定到1,315,547个可及性区域（ACR），根据其相对于基因的位置，进一步分成了基因体(g)-启动子(p)-远端(d)类型的峰（Fig 2a），p-ACR和g-ACR都与转录激活相关（Fig 2a-b）。
Fig 2c-f
在胚胎发生过程中，p-ACR和d-ACR的增加和减少是不同的，许多基因在DPA2后获得了p-ACR，但是在DPA12和DPA16胚胎发育后期失去p-ACR，75%的ACR在DPA8时表现出急剧的爆发，然后再DPA12迅速下降（Fig 2c）。
作者进一步分析了DPA8中“瞬时”的d-ACR和DPA8、DPA6或DPA12中“恒定”的d-ACR的特征（Fig 2d-e）。“恒定”的d-ACR通常富集了活性染色质状态，如Pol II和H3K27ac修饰，同时缺乏转座子和异染色质相关的组蛋白修饰，如H3K9me2。相比之下，“瞬时”的d-ACR区域包含了更高比例的转座子且相对富集H3K9me2（Fig 2e）。此外，作者还分析了非编码RNA的含量，发现DPA8与DPA6和12相比，具有更高的非编码RNA水平（Fig 2f）。
Fig 2g-h
值得注意的是，超过74%的“瞬时”d-ACR标记的非编码RNA是从转座子位点转录的（Fig 2g）。因此，在DPA8时期的某些d-ACR的爆发可能与胚胎发育期间转座子的瞬时表达相关。
除了时间动态之外，六倍体小麦的亚基因组在染色质可及性方面表现出相当大的差异，尤其是在着丝点和端粒区域（Fig 2h）。
总之，再胚胎发育过程，近端和远端的染色质可及性经历了不同程度的重编程。有趣的是，亚基因组中大部分远端调控和染色质可及性的不对称性在六倍体基因组中表现出独有的特性。
结论3 胚胎发育过程物种特异性的染色质重塑
Fig 3a
为了推断染色质状态，作者利用ChromHMM整合了四个阶段（DPA0、2、4、8）的8种组蛋白修饰和Pol Ⅱ的占位情况。一共鉴定出12种染色质状态，进一步可以分成五大类：启动子(Pr)、增强子(EnL)、转录(Tr)、多梳家族(PcG)、异染色质(Hc)（Fig 3a）。
Fig 3b
启动子和增强子更富含H3K27ac、ATAC-seq信号、组蛋白变异体H2A.Z和Pol II占有率（Fig3a、3b）。
Fig 3c-f
正如预期的，不同胚胎阶段之间的染色质状态发生了显著变化（Fig 3c），约有10%的基因组在相邻的发育阶段之间改变了染色质状态（Fig 3d），其中以启动子和增强子的变化最为显著（Fig 3e）。
在小鼠和人类中，H3K4me3和H3K27me3在受精后立即发生广泛的重编程，这对早期胚胎发育至关重要。因此，作者研究了小麦胚胎发育过程中上述组蛋白修饰的动态变化。由于这些组蛋白修饰在基因间区域呈现出广泛分布，作者将近端和远端区域分开。全基因组的H3K4me3在近端和远端区域都表现出适度的变化，H2A.Z也是如此（Fig 3f）。相反，H3K27ac在胚胎发育前期急剧下降，然后在中期恢复并保持高水平，随后在晚期和成熟胚胎阶段逐渐减少（Fig 3f）。对于H3K27me3，在胚胎阶段前期发生了急剧的清除，然后在晚期和成熟阶段逐渐恢复并保持高水平（Fig 3f）。
Fig 3g
有趣的是，六倍体小麦的亚基因组即使在同源区域中，也展现出不同的组蛋白修饰丰度（Fig 3g）。H3K27me3在亚基因组之间的变化较活性组蛋白标记（如H3K27ac、H3K4me3）和组蛋白变体H2A.Z更大（Fig 3g）。
Fig 3h
综上所述，作者揭示了小麦胚胎发育过程中组蛋白修饰重编程的物种特异性动态模式（Fig 3f, 3h）。多倍体小麦的不同亚基因组具有不同的组蛋白修饰，尤其是抑制性组蛋白修饰H3K27me3（Fig 3g）。
结论4 H3K27ac、H3K27me3和染色质的重编程调控了胚胎发育早期的基因表达
Fig 4a-g
受精后，母源程序被沉默，然后是合子基因的激活，这个过程中在动物和高等植物中都发生了表观遗传重组。在小麦胚胎发育过程中，基因激活主要发生在DPA2和DPA4，包括与合子激活相关的细胞周期和细胞因子信号通路基因（Fig 4a）。此外，活性的组蛋白修饰H3K27ac和H3K4me3在下调基因中出现了不同程度的降低，而在上调基因中几乎没有变化（Fig 4b），这与哺乳动物中的发现不同。H3K27me3在上调和下调基因中均减少，表明H3K27me3可能不是调控基因差异表达的主要原因。相反，在下调的基因中，染色质可及性变化不大，但在上调基因中有所增加（Fig 4b）。
这些数据表明，活性组蛋白修饰的丧失可能有助于基因沉默，而染色质可及性的增加伴随H3K27me3的减少可能会触发基因的激活。事实上，H3K27ac和H3K4me3中的任一或两者的减弱在下调基因中广泛存在（Fig 4c, d），在同时丧失这两种修饰的情况下，下调基因显著减少。与H3K4me3相比，H3K27ac的重编程效果更为显著（Fig 4d）。
同时出现活性组蛋白修饰降低和转录水平降低的基因主要是一些母源沉默的基因，例如花发育基因AP2、与信号传导相关的基因MAPKKK17，以及花柱发育相关的基因IAA1等（Fig 4e）。
染色质可及性增加的基因与转录上调的基因显著重叠（Fig 4f, g），这些基因的功能与合子启动相关，如DNA复制、细胞周期、异染色质等（Fig 4e）。
Fig 4h-i
在合子启动后，作者观察到DPA4的H3K27me3在全基因组水平出现明显下降，但在DPA8处迅速重建（Fig 4h）。对于必要的胚胎发育基因，如LEC1、BBM、WOX11和ARR12，在胚胎发育前期（DPA4）观察到H3K27me3减少，H3K27ac和ATAC-seq信号增加，而H3K4me3在DPA2处的变化有限（Fig 4i）。
Fig 4j-m
大约90%的H3K27me3消除区域在DPA4到DPA8阶段被重建，伴随了大量新获得的H3K27me3区域（Fig 4j）。H3K27me3的消除与细胞分裂素途径和必要的胚胎基因相关。
整体而言H3K27me3与转录呈明显的负相关（Fig 4k）。然而，仅仅降低H3K27me3无法解释从DPA2到DPA4的基因激活（Fig 4k, l）。值得注意的是，H3K27me3的减少区域与H3K27ac和染色质可及性的增加区域高度重叠（Fig 4l）。重叠区域的基因表现出显著的激活，因此作者认为增加染色质可及性会产生更显著的效果（Fig 4l）。
此外，在DPA4后，有561个基因的转录激活表现出与染色质可及性增加高度同步的模式（Fig 4m），这种同步可能确保了基因激活的适当时机。例如，胚胎发育的必要基因LEC1首先被激活，然后是多能基因ARR12，以及后续的分化基因XMXL5和IPS2（Fig 4m）。总之，这表明H3K27me3的重置会消除胚胎发育基因上的染色质水平的障碍，这些基因随着染色质可及性的增加而逐渐激活。
相比之下，全基因组的H3K27me3在DAP6逐渐获得，并在DAP8时完全恢复（Fig 4h, i），这表明重新获得H3K27me3可能对胚胎的正常发育至关重要。进一步，作者通过实验验证证明了PRC2介导的H3K27me3的积累对小麦胚胎发育是必要的。
总体而言，组蛋白修饰的重编程，特别是H3K27ac和H3K27me3，以及在胚胎发育早期建立的染色质可及性对胚胎发育至关重要。
结论5 转录因子介导的调控网络调控了胚胎发育过程
Fig 5a-d
胚胎发育过程伴随了精细的转录调控，转录因子与靶基因以及转录因子自身之间复杂的关系可以通过连续的转录轨迹来很好地体现（Fig 5a, b）。作者根据主成分分析展示从胚胎发育早期到成熟胚胎的各个阶段的转录和染色质可及性的伪时间序列（Fig 5b），观察到基因表达与染色子可及性（p-ACRs）存在明显的关联（Fig 5c），推测p-ACR和转录因子共同调控这些基因的表达。作者比较了胚胎发育早期（C1和C2）以及胚胎发育晚期（C3和C4）中表达的基因的功能，发现早期上调的基因主要参与细胞分裂，而晚期表达的基因主要参与细胞类型的分化（Fig 5d）。
Fig 5e-g
作者对C1-C4的pACR进行了转录因子预测，早期形成的pACR可能与促进细胞全能性的基因相关，如LEC1、MYB118、WUS等（Fig 5e）。相比之下，后期的pACR主要与种子休眠等功能相关（Fig 5e）。
进一步，作者结合转录因子结合位点以及基因共表达来解析该过程的调控关系，共鉴定到1158个成对的TF-cis motif的相互作用，包括154个靶基因，695个ACR和191个转录因子（Fig 5f）。通过提取转录因子-转录因子网络（Fig 5g），作者确定了网络中心的四个关键转录因子，包括TCPs、ARFs、MYBs和WOXs。
Fig 5h-i
作者发现LEC1、MYB118和ZHD15基因在胚胎发育早期高度表达，LEC2的表达高峰出现在过渡阶段，BBM逐渐在胚胎发育中期被诱导，这表明存在一个潜在的调控顺序（Fig 5h）。进一步，作者通过实验验证了LEC1、MYB118、ZHD5、LEC2和BBM基因的调控关系（Fig 5i）。
结论6 胚胎成熟过程中与全能性降低和限制器官发生相关的染色质凝聚
Fig 6a-c
随着胚胎的成熟，细胞逐渐失去全能性并发生分化。在这一部分，作者想知道全能性是如何减弱的以及为什么在胚胎成熟期间不形成末端器官。首先，作者鉴定了在末端器官（如根和叶）中特异性表达的基因。作为对照，全能基因（Fig 6a中的Toti）是胚胎发育阶段高表达的基因。作者评估了Fig 6a中三类基因的染色质景观，发现H3K27me3修饰在末端器官特异性基因上消散，ATAC-seq信号在全能基因和特异性基因上明显存在（Fig 6b-c）。在胚胎愈伤组织（EC）中，全能性基因和器官特异性基因的启动区域具有高染色质可及性和低H3K27me3水平（Fig 6b-c）。因此，作者提出染色质可及性和H3K27me3协同调控器官识别基因的激活潜力，染色质可及性而非H3K27me3介导的抑制对于全能性基因的沉默是不可或缺的。
Fig 6d-f
事实上，几个与再生相关的基因，如REV、SAUR41、CKX7和DDM1，在胚胎成熟时逐渐表达下降，伴随了染色质可及性的降低，但在愈伤诱导过程中被激活（Fig 6d）。
最后，我们分析了植物器官形成背后的基因调控逻辑。WRKYs和AtHB 的转录因子足迹在根和叶的特异基因的调控区域中富集，而bHLH和GATA的转录因子足迹在两个基因集中都富集）。值得注意的是，几乎有半数转录因子没有显示出器官特异性表达，而是表现出广谱模式，这表明转录因子的表达本身不能决定器官特异性。例如，尽管WRKY75在胚胎成熟期间表达并具有与根中的AMT1;1结合而激活的能力（Fig 6e），但由于启动区域的H3K27me3抑制和低染色质可及性，AMT1;1被沉默了（Fig 6f）。
综上，作者认为H3K27me3和染色质可及性的变化影响了小麦正常的胚胎成熟过程，降低了全能型但是并没有导致广泛的器官发生。
结论7 表观遗传调控有助于多倍体基因组的亚基因组分化和阶段特异性的表达变化
Fig S8
由于小麦是一种异源六倍体，作者进一步研究了表观调控多倍体的影响。作者首先基于基因的进化年龄对基因进行了聚类（Fig S8a），发现大多数属于小麦属的特有基因，特别是来自A. tauschii（DD）的基因，没有参与胚胎发育（Fig S8a、S8b）。对于存在于所有三个亚基因组中的同源三联体，除了已经被报道的组蛋白修饰外，染色质可及性也与差异表达模式相关。至于差异表达的同源三联体，被抑制的三联体通常多于表达的三联体，D亚基因组的被抑制的三联体相对较少，而A和B亚基因组的被抑制的三联体较多。在胚胎发育中期，较胚胎发育早期和晚期，有更多的平衡表达的三联体存在（Fig S8c）。
Fig 7a-e
多倍化可能驱动基因的新功能化或亚功能化，以赋予表型的可塑性。作者通过计算六倍小麦（AABBDD）与祖先（AA/BB/DD/AABB）之间的Pearson相关系数，把基因分成功能失调类（dysfunction）、中间类（middle）和保守类（conserved, Fig 7a）。如预期那样，保守类基因大多是同源三联体，具有亚基因组平衡的表达，显示出更高的序列保守性和更强的负选择（Fig 7b, c）。然而，相当比例的功能失调基因（8%，1096个基因）与祖先相比在六倍小麦中表达发生了变化，但序列变异轻微，并受到强烈的负选择（Fig 7c）。这些基因的启动子，特别是TSS上游约1.5-3kb处，更倾向于被TE插入（Fig 7d）。有趣的是，TE插入区域倾向于是染色质可及的并富集了H3K27ac修饰（Fig 7e）。
Fig 7f
例如，TaUGT91C1在六倍小麦中表现出B亚基因组的高表达，与其祖先不同（Fig 7f）。因此，与其A或D亚基因组的对应部分相比，B亚基因组中发现了拥有更高染色质可及性的启动子。
Fig 7g-i
先前的一项关于胚胎发育的研究揭示了在六倍小麦和四倍小麦以及二倍小麦的祖先之间存在一个保守的“沙漏模型”。在这里，作者发现了转录分化的发育阶段特异性模式。在六倍小麦本身以及六倍小麦与其祖先之间的同源三联体比较中，呈现出明显的中期过渡，将两个保守的早期和晚期发育阶段分开（Fig 7a, g）。因此，作者假设不同的调控因素可能导致了这种分歧。事实上，H3K27ac主要对胚胎发育中期产生影响，而不影响早期和晚期阶段，而H3K27me3和染色质可及性则表现相反（Fig 7h）。此外，chromVAR分析表明关键的转录因子主要在胚胎发育中期发挥作用（Fig 7h）。因此，表达分化的阶段特异性模式可能受到胚胎发育早期和晚期的染色质水平的调控，而cis-启动子和转录因子主要在胚胎发育中期发挥作用（Fig 7i）。
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