A combination of extracellular matrix- and interferon-associated signatures identifies high-grade breast cancers with poor prognosis
细胞外基质和干扰素相关信号的组合可识别预后不良的高等级乳腺癌
发表期刊：MOL ONCOL
发表日期：2021 Feb 1
影响因子：6.574
DOI: 10.1002/1878-0261.12912
一、研究背景
乳腺癌（BC）是女性最常见的恶性肿瘤，也是全球癌症死亡的主要原因。尽管在过去的30年里，BC临床结果总体上有所改善，但无论分子亚型如何，高等级BC（HGBC）患者在晚期的生存率仍然很低。大多数常规用于BC分层的生物标志物仍然是 "以癌细胞为导向"，忽略了有助于调控癌症进展的关键因素，如肿瘤微环境（TME）和抗肿瘤免疫力。
二、材料与方法
1 数据来源
1） METABRIC队列：本研究考虑97例化疗未愈的HGBC患者数据的子集，根据ECM3和IFN标志进行预后评价。
2）ECTO队列：ECTO病例队列是131个HGBC的子集（属于283名患者的TRANS-ECTO1队列），GEP（基因表达谱）是可用的（GSE147472）。米兰Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori(INT)招募的51例ECTO亚组的组织切片用于IHC直接评价免疫TME。
3）INT队列：INT队列包括2008年至2017年在INT接受手术的女性获得的45个HGBC。
2 分析流程
1）RNA的提取和微阵列杂交（INT队列）（GSE147471）
2）基于GEP的ECM3、IFN和PAM50的分类：使用738个ECM基因的大平均子矩阵双聚类确定ECM3样本簇；以IFN元基因分布的第50百分位数为分界点，将患者分为IFN+组和IFN-组；使用PAM50亚型预测器，并对PAM50基因进行中位数定点
3）组织块的病理评估和免疫组织化学分析
4）qPCR
5）CIBERSORT分析
6）统计分析：Kaplan-Meier方法；单cox；多cox；Fisher精确检验；KW检验等。
三、结果展示
01 - ECM3和IFN信号在HGBC患者中的预后作用分析
利用METABRIC数据库，分析了97例化疗未愈的HGBC患者，研究ECM3和IFN信号单独或联合的预后表现。在中位随访时间为184个月时，患者的OS概率为0.41。基于Cox回归分析，ECM3、IFN、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PgR）和PAM-50预测因子与OS没有显著关联，唯一保留统计学意义的变量是诊断时年龄和肿瘤大小。
然而，通过考虑ECM3/IFN联合变量，观察到一个统计学显著的对数秩检验（图1A）。特别是，ECM3+/IFN-类别确定了BC患者与其他患者相比预后最差（图1A）。通过将患者分为两类（ECM3+/IFN- vs 其他）的dECIF变量证实了这一结果，其危险比（HR）等于3.20（图1B），支持ECM3/IFN联合变量在定义最具侵袭性的HGBC时的潜在临床相关性。
图1 基于ECM3/IFN和dECIF变量的未治疗METABRIC患者16年OS概率
值得注意的是，dECIF与任何其他考虑的临床变量没有显著关联（图2）。作者证实了dECIF变量在调整诊断时的年龄、肿瘤大小、ER状态、PgR状态和PAM50预测因子后的预后作用。这些研究结果支持TME特征的相关性，这些特征由ECM3/IFN联合变量重述。
图2 根据METABRIC队列中的临床变量和PAM50，dECIF变量的分布
02 - 根据dECIF分类对肿瘤微环境进行特征分析
基于IFN元基因和T细胞元基因表达之间的相关性报道，以及BC患者ECM3+亚组中免疫基因缺乏富集，作者通过联合考虑ECM3和IFN标记物来研究免疫TME。
在METABRIC队列中，观察到dECIF与CD33或CD3基因表达水平之间有统计学意义（图3）。与其他样本相比，ECM3+/IFN-样本中CD33特别高（图3A），而CD3水平较低（图3C）。ECTO队列中也记录了同样的关联模式，尽管只有CD3有统计学意义（图3B,D）。
图3 归一化基因表达水平与dECIF变量之间的关联
在分析CIBERSORT数据时，观察到dECIF与巨噬细胞_M1、B细胞_记忆和T细胞_CD8之间的边缘关联（图S2）。
图S2 根据dECIF变量计算的CIBERSORT人口分布情况
接下来的目标是验证从METABRIC和ECTO基因谱分析中出现的TME特征。鉴于缺乏METABRIC组织标本，作者检查了131个ECTO可用的档案FFPE块中的51个在H＆E染色切片上的TILs，并通过免疫组化（IHC）检查免疫标志物。分类为ECM3+/IFN-的样本在最低的TIL浸润类别中显示出最高的病例比例（图4A）。
此外，IHC分析显示，骨髓CD33+细胞在肿瘤亚组中的比例存在边缘显著性差异（图4B），ECM3+/IFN-亚组包括归入CD33低类别的HGBC的最低比例，以及不表达活化标志物（图4C）的样本的最高比例。PDL-1在任何组中无论是肿瘤细胞还是免疫细胞都没有表达（图4D,E）。
图4 根据dECIF变量，IHC标志物较低或较高的患者百分比 条形图显示每个IHC标志物低于（蓝色条形图）或超过（红色条形图）阈值的患者百分比
03 - 减少ECM3和IFN的签名
为了促进ECM3/IFN分类在临床上的应用，从原来的高维度ECM3签名和IFN元基因入手，利用ECTO分子数据开发了一个更加简约的模型，以获得性能不大幅下降的减量签名。
第一步，分别对32个和18个基因进行了显著的去调控，如原ECM3或IFN签名。迭代程序从相关对开始，并使用Bonferroni校正。最后，使用基于这些选定基因的多变量分析来确定两个签名，分别为ECM3或IFN的8个或4个基因。
为了增加对研究结果稳健性的信心，使用具有可比特征的独立HGBC队列（INT队列）对结果进行验证。通过原始签名和缩减签名获得的ECM3和IFN状态之间的一致程度得到了证实，ECM3的k值为0.90，IFN的k值为1。即使在METABRIC数据集上评估互换性时也观察到了几乎完美的一致性，ECM3的k值为0.98，IFN的k值为0.88。
考虑到为METABRIC数据观察到的高水平的一致性，从ECM3/IFN状态开始进行生存分析，通过减少签名来定义。从ECM3/IFN变量获得了一个统计学意义上的HR值等于2.60，具体对比为ECM3+/IFN- vs ECM3-/IFN+（图5）。
图5
由于在METABRIC队列中发现dECIF和CD3之间以及dECIF和CD33之间存在显著关联（图3A,C），因此进一步研究这些基因的预后作用。通过实施单变量Cox回归模型，发现只有CD3与OS显著相关。即使调整了CD3水平，dECIF变量仍保留了其显著性。
04 - ECM3和IFN减少的标志物的临床使用
为了简化其临床应用，作者接下来开发了一种qPCR方法，用于实现ECM3/IFN分类，而不需要运行GEPs。采用qPCR对116个具有优质RNA的ECTO样本进行技术验证，以验证ECM3和IFN减少的信号。在数据归一化方面，使用了RPLP1基因的表达水平，结果发现RPLP1基因的表达水平比其他管家基因候选基因更稳定。
用qPCR分析的所有基因都保持了相同的调控模式。通过评估qPCR检测的基因表达与原始GEP之间的关系，得到了显著的相关系数，从0.46到0.79。回归线以及ECM3和INF分类器的95%CI，如图S6所示。通过考虑dECIF变量，根据原始和qPCR签名对样品进行ECM3/IFN状态一致性测试。109个样本的k值为0.65，显示出相当高的重复性。
图S6 Affymetrix和qPCR数据之间的相关性
四、结论
本研究表明，通过结合两种不同的反映ECM和免疫细胞的基质分子信号，可以生成一种新型的预后临床适用分类器。该标志物不仅能够识别预后最差的HGBCs患者，而且能够识别需要更积极治疗的患者，以及由于PD-1/PD-L1的低表达和高骨髓浸润而应排除在单药PD-1/PD-L1阻断治疗之外的患者。最后，应用基于qPCR的方法来测量我们的新预后分类器，使得这个分子工具特别适用于临床实践。
网友评论