二十四型 第 3 型 细胞凋亡
二十四型 第 3 型 细胞凋亡
一、凋亡概述
1.细胞凋亡的研究历史
细胞凋亡(apoptosis)
2.凋亡的形态特征
-
细胞丧失了表面结构，形成光滑的轮廓，从周围的正常细胞组织中分离了出来。
-
细胞体积变小。
-
细胞核内染色质结构改变。
-
染色质固缩
-
染色质边缘化
-
细胞核内胞浆紧实
-
细胞核的核膜折叠
-
-
细胞形成凋亡小体
-
凋亡细胞/凋亡小体被识别和被吞噬。
3.凋亡的细胞学过程
凋亡早期：染色质紧实、胞浆固缩、核膜发生折叠
凋亡晚期：细胞核碎片化、细胞出芽/起泡、细胞碎片化
凋亡末期：细胞清除阶段
二、凋亡通路和关键分子
1.凋亡通路核心分子家族成员的介绍
Bcl-2 家族:
Bcl-2 家族最有代表性的家族成员就是 Bcl-2 分子。Bcl-2 分子内含有四个同源结构域，分别是 BH1-BH4。
-
Bcl-2 亚家族。几乎都有 BH1 和 BH2 结构域。对细胞凋亡起到抑制的作用。
-
Bax 亚家族。都含有 BH3 结构域，也含有其他的 BH 结构域。促进细胞凋亡的作用。
-
BH3 亚家族。只含有 BH3 结构域。促进细胞凋亡。
明星分子：Bcl-2 分子和 Bax 分子。
Bax 高表达，对死亡信号敏感，促进凋亡。
Bcl-2 高表达，Bcl-2 和 Bax 形成异源二聚体，抑制凋亡。
细胞内 Bcl-2/Bax 的比例对决定细胞凋亡的敏感性起到重要作用。
Caspase 家族:
Caspase 蛋白水解酶有三个特征：
1)都是半胱氨酸蛋白酶;
2)作用位点都在天冬氨酸残基后的位点;
3)Caspase 家族成员都是以酶原的形式存在，需要经过活化。
按照功能分为三组：
-
凋亡启动亚类 Caspase 蛋白酶 ：包括 Caspase-2、8、9 和 10。它们是细胞凋亡的起始分子。
-
凋亡效应亚类 Caspase 蛋白酶：包括 Caspase-3、6 和 7。它们是具体执行细胞凋亡的效应分子。因此凋亡效应类的 Caspase 蛋白酶在信号传导的过程中始终处于凋亡启动类 Caspase 蛋白酶的下游。
-
细胞因子激活类 Caspase 蛋白酶：包括 Caspase-1、 4、5 和 13。与细胞凋亡的关系不是很密切，可能与多种炎症因子或者细胞因子的成熟有关。
2.细胞凋亡的机制/通路
介导凋亡的通路有三条：分别是线粒体通路、内质网通路、死亡受体通路。
1)线粒体通路
死亡信号激活含 BH3 结构域的 Bcl-2 家族成员，例如 Bax。Cyt C 的释放是线粒体凋亡路径的关键限速步骤。
2)内质网通路
内质网是细胞内蛋白质合成的主要场所，同时也是 Ca2+的主要储存库。
3)死亡受体通路
死亡受体介导的信号通路图
三、凋亡的检测方法
1.形态学方法
光学显微镜（LM）细胞缩小、核浓缩、细胞周围透明圈相差显微镜（PCLM）细胞鼓泡，凋亡小体
透射电镜（TEM）微绒毛消失、核染色质沿核膜分布、新月体形成、凋亡小体
激光共聚焦（CLSM）凋亡细胞固缩染色质及核碎片定位扫描电镜（SEM）细胞表面泡状突起
流式细胞仪（FCM）低前向散射光、高侧向散射光缩时摄影术（TLP）凋亡细胞的形成过程
2.流式细胞仪检测(Annexin V-PI 双染色实验)
Annexin V 阴性且 PI 阴性(双阴性细胞)，这类细胞是活细胞;
Annexin V 阳性且 PI 阴性，这类细胞是早期凋亡的细胞;
Annexin V 阳性且 PI 阳性(双阳性细胞)，这类细胞是晚期凋亡或者是坏死的细胞;
Annexin V 阴性且 PI 阳性，这种情况可能是由于非特异性染色导致的。
3.核酸电泳检测细胞凋亡(DNA 片段检测法)(TUNEL 法)
出现的 DNA 片段都是 180-200bp 的片段或者是 180-200 bp 整数倍的 DNA 片段。在凝胶电泳中，如果出现这种特征性的电泳条带，就可以判断细胞发生了凋亡。
缺点:
1)坏死的细胞也有 DNA 断裂，也可以呈现出 TUNEL 反应阳性，因此会带来结果的干扰;
2)TUNEL 结合免疫组化检测凋亡时，细胞的固定过程对检测的影响很大，切片的大小、厚薄，都会直接影响到固定效果，对于最终的检测结果都会有较大的影响。
4.凋亡明星分子检测
采用的是 western blot 的方法检测蛋白。
结合线粒体通路，首先是检测激活的 Cas-9。然后激活的 Cas-9 再级联放大激活下游的 Cas-3。前体分子是 Pro-cas-9 和 Pro-cas-3。Cas-3 激活后可以作用于很多的底物之上， 最常检测的 Cas-3 的底物是 PARP 分子。
在凋亡发生时，Bcl-2 家族成员发挥了重要的作用。通过 western 检测 Bcl-2 和 Bax 的表达量，通过 Bcl-2/Bax 的比值， 表征细胞凋亡的程度。
对于死亡受体介导的凋亡通路，Fas、FasL、TNF 和 TNFR，都是常规需要检测的明星分子。
四、全文总结
1.凋亡是严格受到细胞信号调控的自主性消亡的过程。它涉及到一系列的基因激活、表达和调控作用。在整个凋亡过程中，细胞膜的结构完整，胞内染色质皱缩而且DNA断裂，并形成凋亡小体，最终被其他细胞吞噬后消除。在整个凋亡的过程中，没有细胞内容物的外泄，因此不会引起炎症反应。
2.根据凋亡的整个细胞学过程，可以将凋亡的过程分为三个阶段:早期(earlyphase)，晚期(laterphase)和末期(atlast)。也可以把凋亡的早期和晚期合二为一，称为凋亡的细胞死亡阶段(thedyingprocess);把末期称之为凋亡的细胞清除阶段(theeliminationprocess)。
3.在凋亡的发生过程中，细胞表现出非常明显的形态学特征:1)细胞丧失了表面结构;2)细胞体积变小;3)细胞核内染色质结构皱缩;4)细胞形成凋亡小体;5)凋亡细胞/凋亡小体被识别和被吞噬。
4.凋亡通路核心分子家族成员有两个:Bcl-2家族和Caspase家族。Bcl-2家族成员中，有一类抑制凋亡的分子，以Bcl-2分子为代表;Bcl-2家族成员中，还有一类促进凋亡发生的分子，以Bax分子为代表。Caspase家族成员中，一类是凋亡启动分子，包括Cas-2,8,9和10;一类是凋亡效应分子，包括Cas-3、6和7;还有一类caspase的亚家族分子和凋亡的关系不大。
5.介导凋亡的通路有三条:1)线粒体通路;2)内质网通路;3)死亡受体通路。
1)线粒体通路，是最重要的介导凋亡的通路。在线粒体通路中，细胞色素C的释放是关键步骤。释放的细胞色素C和Apaf-1以及Pro-cas-9形成复合物，激活Cas-9。激活后的Cas-9，再激活Cas-3和7，向下传递凋亡信号。
2)内质网通路:当内质网内Ca2+离子失调或者内质网内蛋白过量积累，激活内质网通路。在内质网通路中，涉及到Cas-7，Cas-12和Cas-3的参与。
3)死亡受体通路是最为复杂的。最常见的死亡通路信号是FasL-Fas通路和TNF-TNFR通路。
6.检测凋亡的方法有很多，包括:1)基于显微镜观察的形态学检测;2)AnnexinV-PI双染色实验，结合流式细胞仪检测;3)DNA片段检测法;4)ELISA检测法;5)TUNEL法;6)线粒体跨膜电位检测法;7)明星分子检测。
网友评论