大家好，易基因文献科普栏目又来啦！今天要分享解读一篇发表于Cell Research（IF 25.617）的新冠病毒基因组RNA m6A甲基化研究的文章，本文通过RIP-seq和miCLIP以单碱基分辨率鉴定了SARS-CoV-2（新冠病毒）基因组RNA中m6A位点，发现其基因组RNA上m6A的动态修饰，并通过进一步的功能实验，揭示了m6A甲基化对病毒复制和感染，以及和宿主互作进程的调控。
期刊介绍：
Cell Research (CR )： CR刊登生命科学领域具有特殊意义或技术进步的原创研究结果，包括表观遗传学、RNA生物学、免疫与分子发病机制等分子和细胞生物学相关内容。是中国科学院 (CAS) 分子细胞科学卓越创新中心主办的，与Springer Nature 合作出版的国际性期刊，在JCR一区中排名前十，是Springer Nature系列中分子细胞生物学领域的重要杂志。
关于RIP-seq和miCLIP
RNA免疫共沉淀结合高通量测序（RNA immunoprecipitation sequencing, RIP-seq）是利用特异性抗体，将与相应蛋白结合的RNA富集沉淀，并通过高通量测序加以鉴定的研究技术，通过该技术能够研究RNA与蛋白的相互作用，获得RNA与蛋白的结合位置、结合基序、结合强度等信息，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具。
m6A单碱基分辨率紫外交联沉淀（m6A individual-nucleotide-resolutioncross-linking and immunoprecipitation，miCLIP），是利用m6A抗体和紫外线交联，结合高通量测序，研究m6A转录组图谱的技术。miCLIP是一种高灵敏度工具，能对单个m6A残基进行高分辨率检测，可精确定位转录组中的m6A修饰，并对整个RNA进行m6A聚类分析。
标题：Them6A methylome of SARS-CoV-2 in host cells
期刊：Cell Research (CR）
2021影响因子(IF)：25.617
发表时间：2021.1.28
技术平台：RIP-seq，miCLIP-seq
1、研究目的：
自 2019 年 12 月以来，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2 (SARS-CoV-2) 引起的COVID-19迅速在全球蔓延并成为大流行病，严重威胁人类健康和公共卫生安全。虽然开发了疫苗和抗病毒药物以预防病毒感染和治疗疾病，但对新冠病毒与宿主之间的相互作用知之甚少。
N6-甲基腺苷(m6A)是于1974年首次发现的，哺乳动物细胞中mRNA和lncRNA最常见的内部修饰，过程可逆，由甲基转移酶、去甲基化酶以及识别蛋白动态调控，同时在多个病毒的RNA转录物中也有发现，其参与了病毒的基因表达调控并影响病毒的复制。
为了了解SARS-CoV-2 病毒基因组中的m6A修饰，以及宿主与病毒基因组RNA的相互作用，文章作者设计了SARS-CoV-2 病毒在人和猴细胞中的侵染实验，通过RIP-seq和miCLIP技术鉴定分析了基因组RNA中的m6A修饰位点，并通过进一步的功能实验了解m6A甲基转移酶和去甲基化酶，以及识别蛋白对SARS-CoV-2基因组的复制以及病毒的复制和感染能力的调控。
2、项目设计：
2.1 样本选取：
人的肝癌细胞系（Huh7）和非洲绿猴的肾细胞系（Vero）在经SARS-CoV-2毒株侵染后的6小时、24小时和56小时后的细胞和病毒样本。
2.2 项目设计流程图：
3.实验结果
3.1 SARS-CoV-2（新冠病毒）基因组RNA的m6A甲基化图谱
通过miCLIP在单碱基分辨率水平鉴定SARS-CoV-2（新冠病毒）基因组RNA的m6A位点，根据参考基因组的示意图，在ORF 1ab中发现3个m6A位点，在ORF 7a中发现1个m6A位点，在N中发现3个m6A位点，在ORF 10中发现1个m6A位点，总共8个m6A位点。由此也发现，m6A的修饰更倾向于发生在病毒基因组的3 '端。
3.2 SARS-CoV-2（新冠病毒）流行毒株的m6A位点突变
收集GISAID中截止7月16日所有的SARS-CoV-2（新冠病毒）全长序列（长度>29,000 bp）的完整元数据，在去除重复序列和低质量序列(>5% NNNNs)后，使用MAFFT 37对所有56143条序列进行序列比对，使用python和Biopython软件包进行分析。共鉴定出有288株流行毒株在m6A核心基序的A或C上存在核苷酸突变，这些突变或会破坏m6A修饰。未发现有流行毒株存在2号位点的核苷酸突变，其余的m6A位点至少有一株流行毒株存在相应位点的突变。1号和3号位点的突变株主要来自欧洲，4号和6号位点的突变株主要来自北美。
3.3 SARS-CoV-2（新冠病毒）m6A甲基化修饰调控病毒的复制感染
通过小干扰RNA （siRNA）敲除Huh7细胞中已知的m6A甲基转移酶（writers）、去甲基化酶（erasers）和识别蛋白（readers）。通过western blot和RT-qPCR评估敲除效率。免疫荧光图像和统计结果显示，敲除甲基转移酶METTL3和METTL14后，病毒复制和SARS-CoV-2（新冠病毒）感染的细胞比例明显增加；敲除去甲基化酶ALKBH5后，病毒复制减少；但敲除识别蛋白YTHDF2后促进了病毒的感染和复制。由此可见，m6A对SARS-CoV-2（新冠病毒）感染具有负调控作用。
3.4 SARS-CoV-2（新冠病毒）感染对宿主细胞m6A甲基化水平的影响
对未感染SARS-CoV-2（新冠病毒）的Huh7细胞和感染病毒的Huh7细胞分别在120 hpi时提取细胞RNA进行RIP-seq实验。实验发现，SARS-CoV-2感染导致细胞内编码序列（CDS）区域m6A水平升高，并伴随3 ' UTR区域m6A水平下降。与未感染Huh7细胞相比，感染SARS-CoV-2（新冠病毒）的Huh7细胞m6A总体强度显著增加，提示病毒感染或改变了宿主m6A甲基化水平。
4、关键图形
Fig. 1 Landscape of m6A methylome in
positive-sense genomic RNA of SARS-CoV-2.
Fig. 2 m6A substitution among diverse
SARS-CoV-2 isolates.
Fig. 3 Topology of m6A methylome in
negative-sense RNA of SARS-CoV-2.
Fig. 4 m6A inhibits SARS-CoV-2
replication.
Fig. 5 SARS-CoV-2 infection influences m6A
methylome of Huh7 cell transcripts.
易基因小结
该研究首次系统分析了SARS-CoV-2（新冠病毒）的m6A修饰，发现在人和猴细胞中的SARS-CoV-2（新冠病毒）基因组RNA以及反义链RNA上，m6A存在动态修饰。使用RIP-seq和miCLIP技术，单碱基分辨率鉴定了总共 8个m6A位点，并通过系统进化分析发现，全球不同地区均出现了一系列携带特定m6A修饰位点突变的变异株，在美国等地的变异株还形成了独特的分支。进一步的功能实验发现，m6A甲基转移酶METTL3/14和去甲基化酶ALKBH5分别负调控/正调控SARS-CoV-2基因组的复制，m6A识别蛋白YTHDF2的降低也能促进病毒的复制和感染能力。另外还发现SARS-CoV-2（新冠病毒）的感染会改变宿主m6A的甲基化水平，这表明m6A参与了宿主与病毒的相互作用。总之，该研究结果分析了SARS-CoV-2（新冠病毒）感染期间宿主和病毒的m6A甲基化图谱，发现了m6A在SARS-CoV-2（新冠病毒）传播和发病机理中的潜在作用，使m6A作为SARS-CoV-2（新冠病毒）复制和感染的负调节因子，为疫苗和抗病毒药物的开发提供了潜在的新策略。
参考文献：doi.org/10.1038/s41422-020-00465-7
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