一代测序（sanger测序法、双脱氧法测序）
ABI公司在双脱氧法测序的基础上进一步开发出荧光标记的双脱氧法测序试剂盒（BigDye试剂）。接着再结合毛细管电泳生产出“ABI3730”和“ABI3500”等测序仪。
原理：
双脱氧法测序的第一个核心技术就是在用DNA聚合酶合成DNA链的过程中掺入双脱氧核苷酸（ddNTP）。
天然DNA组成元件是单脱氧核苷酸（dNTP），其糖基的3’和5’位各有一个羟基，5’位的羟基连接到上游的磷酸基团，不断重复，形成一条DNA骨架链。
Sanger的方法就是用化学合成的方法合成出3位’没有羟基的核苷酸，这就是双脱氧核苷酸。
因为缺少3位’的羟基，无法与下一个dNTP结合，DNA链的聚合反应也就此终止，不再往下延伸。这样在DNA链聚合过程中，通过掺有ddNTP的dNTP进行聚合反应，得到一系列不同长短的DNA片段，每个片段的3'末端都是一个双脱氧的核苷酸残基，并且这个核苷酸的残基是与模板上对应位置的碱基互补的。
BigDye的创新点在于它在ddNTP的基础上，再在碱基上，加上四种不同颜色的荧光发光基团。
实际测序过程中先在反应体系中加入要测序的DNA模板，一般是经过纯化的质粒，或者经过纯化好的PCR扩增片段，再加入与测序起始位置相互补的测序引物DNA，（引物的作用是与模板的特定序列位置相结合，引导聚合反应发生，同时确保DNA聚合反应从已知的、确定的起点开始），然后加入BigDye试剂，进行反应。
BigDye试剂包括四种荧光标记的ddNTP，dNTP，DNA聚合酶，镁离子，PH缓冲液等。
反应得到的一系列不同长短的DNA片段经过纯化后，去掉游离的荧光ddNTP单核苷酸，上机测序。
上机测序时现在玻璃毛细管中注入丙烯酰胺溶液，接着使用紫外光照射，丙烯酰胺在紫外电离作用下，发生聚合反应，变成聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶对于在其中电泳的核酸有分离作用。片段短，跑得快。然后把混合DNA片段加到有聚丙烯酰胺凝胶的毛细管的一端，在毛细管的两端加上高电压，DNA片段就在电场的作用下，从负极向正极电泳。在毛细管正极末端使用激光照射。在通过激光扫描点时，荧光基团就会发出特定颜色的荧光。
然后就得到了这样的图片，横轴是电泳时间，纵轴是荧光强度。
同时，横轴也是碱基的先后次序。峰越高、越尖，与别的峰交错越少，则这个碱基判读准确性越好。
ABI3730可测序长度一般为700bp以上，ABI3500可测序长度一般为850bp以上。
二代测序
边合成变测序（sequence by synthesis, SBS）——合成
image.png
第一步： 构建DNA文库
超声波将DNA分子打断成300-800bp长序列片段（人类基因组打成300-500bp），用酶补平为平末端，然后3‘端加一个A碱基（因为接头的3‘端有一个突出的T），再在两端加上互补配对的adapter，再通过PCR扩增达到一定浓度，构成单链DNA文库。
第二步： 上样
flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，测序就在此进行。上面构建好的文库中的待测序列事先配置好一定的浓度，经过这里的时候，会在特异的化学试剂作用下，强力随机地附着在lane上，与上面的短序列配对。上样的结果就是lane吸附住了冲过来的DNA，并且可以在表面进行桥式PCR扩增。
第三步：桥式PCR
第一轮扩增模版：flowcell表面固定的序列 --> 模版链
去杂：加入NaOH强碱性溶液使双链DNA变性，互补链由于和lane上短序列强力连接固定住了；模板链失去了双链氢键连接，好似悬空，它会被洗脱
**桥式形成： **加入缓冲溶液，互补链的p7‘和lane上的p7互补（但还是一个lane中的）就像下图这样（摘自illumina官网）目的是快速扩增lane p7接头连接的链，也就是下图中的Forward Strand，它和我们的模版链是一致的。我们后来测序只用这一半
image.png
桥式PCR： PCR弯成桥状，一轮桥式扩增一倍
循环： 大约35个循环后，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，称为cluster，这是一群完全相同的序列。目的在于实现放大单一碱基的信号强度，满足后期测序需求
解链： 桥式PCR完成后，形成了很多的桥形的互补双链，再次强碱解链。
这一次不再进行复制，而是利用一种酶--甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）选择性的切掉lane 上p5‘ 连接的链，只留下了与lane p7连接的链即Forward Strand
第四步：测序
illumina采取了“一次加一个荧光碱基，用完失效”的办法确定cluster的碱基排序顺序。
边合成变测序——测序
一轮测序是这样完成的：
双端测序之Forward Strand：
先是primer结合到靠近p5的sequencing primer binding site1上，再加入特殊的dNTP【它的3‘ 羟基被叠氮基团替代，因此每次只能添加一个dNTP；还含有荧光基团，能激发不同颜色】；在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉；再加入激发荧光缓冲液，用激光激发荧光信号，光学设备记录荧光信号的记录，计算机将光学信号转化为测序碱基。
再向下一轮：再加入化学试剂淬灭荧光信号并使dNTP 3’ 叠氮基团变成羟基，这样能继续向下进行再加一个，并且保证这个不再发出荧光。如此重复直至所有链的碱基序列被检测出。得到了Forward Strand序列。
Index测序：上面的循环结束后，read product被冲掉，index1 primer和链上的index1 互补配对，进行index1的检测。测完后，洗脱产物，得到index1 的序列。接下来p5与lane上的p5‘配对，测得了index2，并洗脱。
双端测序之Reverse Strand：
洗脱掉index2 产物后，还是一个桥式扩增，得到双链，再变性得到原始Forward strand 和 新的Reverse Strand， 除去测完的Forward strand。然后和测Forward一样，也是先连接primer，只是连接的位点是Primer Binding Site2，测完后得到reverse strand序列。
single-end
只将index，Primer binding site以及P7/P5添加到 fragamented DNA片段的一端，另一端直接连上P5/P7，将片段固定在Flowcell上桥式PCR生成DNA簇，然后单端测序读取序列。
网友评论