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下图为某一条RNAseq从数据预处理，序列回帖到数据可视化的工作流程，包含了较多的软件（Linux环境运行）和若干个包（R语言环境运行），本系列将按下图，对每一个步骤进行学习和理解。
某RNAseq分析流程
FeatureCounts
FeatureCounts是一款超快速准确读段总结程序。
FeatureCounts是一款高度有效通用的读段总结程序，可针对不同基因组特征（例如，基因，外显子，启动子，基因体，基因组箱（*）和染色体位置）将已比对的读段进行计数。该程序可用来对RNAseq和基因组DNAseq读段进行计数。
输入与输出
FeatureCounts使用SAM/BAM文件以及一个注释文件（包括feature的染色体坐标）作为输入。程序会输出比对上不同feature（或多个feature）读段的数量。同时，程序也输出对总体总结结果的统计信息，包括成功比对的读段数和因不同原因未能成功比对的读段数。
注释文件应该以GTF格式或简化版的SAF文件作为输入。格式如下所示：
GeneID Chr Start End Strand
497097 chr1 3204563 3207049 -
497097 chr1 3411783 3411982 -
497097 chr1 3660633 3661579 -
Features和meta-features
所提供注释文件每一个条目都可视为一个feature（或外显子）。meta-feature是一组feature（或基因）的聚合。FeatureCounts使用在GTF文件中可获得的gene_id属性使不同feature分组到meta-feature中，也就是说，属于相同的meta-feature的不同feature拥有相同的基因id。
FeatureCounts能在每一个feature水平或meta-feature水平对reads进行计数。当在meta-feature水平总结读段时，对包含于相同meta-feature的features获取的读段计数将会被相加在一起，以生成相应meta-feature的读段计数。
读段与features的重叠
如果至少一个读段base被发现与feature重叠，该读段就与一个feature重叠。对双端测序数据，如果该碎片中两个读段中的任何一个被发现与feature重叠，该片段就被视为与该feature重叠。
默认情况下，FeatureCounts不会对与超过一个feature（或一个meta-feature）重叠的读段在相应水平进行计数。使用者能够使用 -O 选项命令FeatureCounts以计数此类读段（它们将会被分配给所有重叠的feature或meta-feature）。
需要注意的是，当在meta-feature水平进行计数时，与多个属于相同meta-feature的feature重叠的读段将总是被该meta-feature计算一次，使得对任何其他meta-feature没有重叠。
部分计数举例
使用5个线程总结单端读段数据：
featureCounts -T 5 -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt mapping_results_SE.sam
总结BAM格式数据：
featureCounts -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt mapping_results_SE.bam
同时对多个数据进行总结：
featureCounts -t exon -g gene_id -a annotation.gtf -o counts.txt library1.bam library2.bam library3.bam
FeatureCounts常用参数
-a # 输入GTF/GFF基因组注释文件(annotation file)
-F # 指定区间注释文件的格式，默认是GTF
-o # 输出文件:可输出raw counts的txt文本及raw counts的summary文本
-p # 针对paired-end数据
-g # 指定统计的meta-feature名称，默认是gene_id
-t # 指定统计的feature名称， 默认是exon
-T # 指定线程数
featureCounts的结果解析
Geneid：基因的ensemble基因号；
Chr：多个feature所在的染色体编号;
Start：多个feature起始位点,与前面一一对应
End：多个feature终止位点,与前面一一对应
Strand：正负链
Length：基因长度
sampleID：一列代表一个样本，数值表示比对到该基因上的read数目
MultiQC可以将多个FeatureCounts分析结果结合在一个网页文件，方便进行评估。
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