双细胞去除与Seurat的交互：在seurat标准流程进行到TSNE和UMAP降维之后，FindAllMarkers之前进行DoubletFinder操作。

确定是否剔除预测双细胞的一般步骤：

1. 查看降维图上预测出来的双细胞位置。在降维图上，真实的双细胞更倾向于处于主群边缘或游离出来。
2. 如果预测的双细胞单独聚成群，查看其marker基因是否具有明显的多种细胞marker。
3. 不是我们主要研究对象的细胞群中的双细胞可以不去除。

注意的问题：https://www.jianshu.com/p/8de4153d6250

DoubletFinder是一个基于R的doublet检测工具，在它的GitHub主页上，作者给出了如何将它与seurat结合进行分析的代码。在实践过程中，小L发现两个问题。

一是作者给出的范例仅针对我们有一个样本数据的情况下。如果我们有多个样本时，在分析的哪一步进行doublet检测就变得复杂起来了。我们是在对数据进行基础的筛选以及去除批次效应（batch effect）之后呢，还是之前呢？是使用原始的reads数呢？还是使用标准化（normalization）之后的reads数呢？

二是使用DoubletFinder最终会产生一个非常大的seurat对象（object），但其中可能有很多信息是我们不需要的，如果不进行合理的信息提取，会占用大量的计算资源，在样本数量多的情况下，甚至会导致更严重的后果。小L习惯使用Rstudio server进行数据分析，在使用DoubletFinder就曾经因为要分析多个sample，数据太大，导致Rstudio server崩溃。几经调试才找到合适的处理的方法。

小L进行了不同的尝试，翻阅了一些资料，还参考了运用类似思路进行doublet检测的不同工具的使用方法，最后得出结论：应该使用DoubletFinder根据它的tutorial直接对多个样本进行依次分析，先判断出每个细胞是否为doublet，再对它们一起进行过滤（filtering）、整合（integration）等操作。因此，我们在DoubletFinder进行分析后，只需要保留它的结论以及pANN值添加到我们原始数据的metadate里，就能进行后续分析了，不需要保留整个DoubletFinder分析产生的seurat对象（object）。

由于这一块的内容比较多，关于scrublet算法的分析、DoubletFinder和scrublet的比较以及相关的代码范例就放到下一篇内容里写。

作者：小L的读博日常
链接：https://www.jianshu.com/p/8de4153d6250
来源：简书
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小L用过DoubletFinder和scrublet，它俩各有特点：

1. scrublet是基于python的。尽管它有非常详尽的tutorial，对于没有python基础的同学，还是有些许挑战。而DoubletFinder则是基于R的，使用R对于很多做scRNA-seq生信分析的同学来说，还是比较自然。

2. 因为scrublt是基于python的，相较于DoubletFinder，它的速度也要快很多。一个10x的样本只需要几分钟到十几分钟就能跑完，而DoubletFinder则需要几十分钟到一个多小时。

3. 最重要的一点是scrublet比DoubletFinder要准确得多。DoubletFinder最终的结果受设定的pANN阈值的影响，结果稳定性不高。小L曾经有一次得到超过90%数据都是doublet的结果。而scrublet的结果则要稳定得多，也符合我们的预期。

总结完毕，下面就是具体的实操了。正如小L在上篇推送中分析的，DoubletFinder的使用应该是针对每一个sample进行单独分析，并在用seurat对数据进行任何处理之前进行。同时因为DoubletFinder非常占用内存，我们需要及时保留我们需要的信息，即每个细胞的预测结果以及pANN值，并把不需要的部分删除。其中大写字母的部分需要大家根据自己的需求进行替换。

library(tidyverse)
library(Seurat)
library(DoubletFinder)

sampleV = c('SAMPLE1', 'SAMPLE2', 'SAMPLE3')
dataL = list()
## create seurat object for all samples
for (sample in sampleV) {
  file_name = str_c('DATA_FOLDER', sample, '_cellranger/outs/filtered_feature_bc_matrix')
  seuratObj_counts <- Read10X(data.dir = file_name)
  seuratObj = CreateSeuratObject(counts = seuratObj_counts, project = str_c(sample, "1"))
  dataL[[sample]] <- seuratObj
}

for (idx in 1:length(dataL) {
  ## preprocessing
  data <- NormalizeData(dataL[[idx]])
  data <- ScaleData(data, verbose = FALSE)
  data <- FindVariableFeatures(data, verbose = FALSE)
  data <- RunPCA(data, npcs = 30, verbose = FALSE)
  data <- RunUMAP(data, reduction = "pca", dims = 1:30)
  data <- FindNeighbors(data, reduction = "pca", dims = 1:30)
  data <- FindClusters(data, resolution = 0.5)
  sweep.res.list <- paramSweep_v3(data, PCs = 1:30, sct = FALSE)
  sweep.stats <- summarizeSweep(sweep.res.list, GT = FALSE)
  bcmvn <- find.pK(sweep.stats)

  ## Homotypic Doublet Proportion Estimate -------------------------------------------------------------------------------------
  annotations <- data@meta.data$ClusteringResults
  homotypic.prop <- modelHomotypic(annotations)           ## ex: annotations <- sample14@meta.data$ClusteringResults
  nExp_poi <- round(0.075*nrow(data@meta.data))  ## Assuming 7.5% doublet formation rate - tailor for your dataset
  nExp_poi.adj <- round(nExp_poi*(1-homotypic.prop))

  ## Run DoubletFinder with varying classification stringencies ----------------------------------------------------------------
  data <- doubletFinder_v3(data, PCs = 1:30, pN = 0.25, pK = 0.09, nExp = nExp_poi, reuse.pANN = FALSE, sct = FALSE)
  ## save results
  dataL[[idx]]$doubFind_res = data@meta.data %>% select(contains('DF.classifications'))
  dataL[[idx]]$doubFind_score = data@meta.data %>% select(contains('pANN'))
}

经过上述处理后，dataL就是由所有sample得到的seurat对象构成的list。其中每一个seurat对象的metadata里包含了pANN值（doubFind_score）以及DoubletFinder的预测结果（doubFind_score）。用dataL，我们就可以根据seurat的教程进行后续的filtering、integration等操作了。需要注意的是，如果sample的数量太多，我们可以通过改for循环里idx的范围，每次只处理3-5个sample并及时保存，来避免内存不够等问题。

scrublet的安装可以在这里找到（https://github.com/swolock/scrublet），使用指南则在这里（https://github.com/swolock/scrublet/blob/master/examples/scrublet_basics.ipynb）。需要注意的是scrublet使用的是解压后的matrix.mtx文件和genes.tsv文件，而cellranger产生的是压缩文件，我们需要先提前解压一下。

在使用指南中更改好matrix.mtx和genes.tsv文件对应的位置之后，我们就可以按照里面的步骤一步步跑下来，得到doublet_scores和predicted_doublets。因为后续小L是用seurat对数据进行处理，所以就将doublet_scores和predicted_doublets单独保存下来，再放进seurat对象的metadata里。其中scrublet_res是scrublet的判断结果而scrublet_score是scurblet得到判断所基于的分数。

## 保存doublet_scores和predicted_doublets (python)
d = {'score': doublet_scores, 'prediction': predicted_doublets}
df = pd.DataFrame(data=d)
df.to_csv(DATA_FOLDER2 + sample + '_doublet.csv', index=False)

## 导入seurat对象的metadata里 (R)
library(tidyverse)
library(Seurat)
library(DoubletFinder)

sampleV = c('SAMPLE1', 'SAMPLE2', 'SAMPLE3')
dataL = list()
## create seurat object for all samples
for (sample in sampleV) {
  file_name = str_c('DATA_FOLDER', sample, '_cellranger/outs/filtered_feature_bc_matrix')
  seuratObj_counts <- Read10X(data.dir = file_name)
  seuratObj = CreateSeuratObject(counts = seuratObj_counts, project = str_c(sample, "1"))
  doublet_info = read.csv(str_c('DATA_FOLDER2', sample, '_doublet.csv'))
  seuratObj$scrublet_res = doublet_info$prediction
  seuratObj$scrublet_score = doublet_info$score
  dataL[[sample]] <- seuratObj
}

不管是使用DoubletFinder还是scrublet，我们最终都获得了一个分数和一个基于分数得到的判断结果。之后的步骤就是大家看一看doublet的分布，和在每一个细胞类型中的比例，来判断doublet的检测结果是否可靠，以及是要移除整一个细胞群还是移除被判定是doublet的细胞了。
祝大家吃好喝好睡好，科研快乐~

DoubletFinder的可重复性问题

作为一个多细胞去除工具，DoubletFinder似乎很流行，另外有文章指出，这个工具相对于其他同类竞品工具具有优势，详见此文：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405471220304592

真的是不是最优秀的我不知道，我一贯对此类benchmark文章持怀疑态度。但似乎有一点比较肯定就是这个工具还可以。但是有一个问题非常的让我恼怒，就是没有重复性，同样的结果，多跑几次后你会发现，每次的结果都不一样。虽然这个差别在此一步是小差别，但是其影响确实很深远的，单从我的个人使用经验来看，DoubletFinder的不可重复直接导致你的最后的cell cluster形状变个不停。

也许你觉得这不是问题，只要保存一下结果下次继续就可以了，或者设施一下set.seed。保存结果，这虽然是个解决方案，但是在分析数据时，如果常需要调整其他的参数，进而必须要重新进行Doublet 去除，就会带来很大的困扰。如果你尝试过set.seed，你会发现根本不管用，那么问题在哪里呢？今天决定决绝这个问题，一劳永逸。

研究源代码后发现，问题的的关键是，该包的作者在多个函数你使用了sample函数，所以这就解释了问什么结果总是变，另外set.seed之所以没用，也是因为这个原因，作者前后在不同的自定义函数里使用了多个含有sample的函数，且每次使用都没有设定seed，在我看来，这应该算是个bug，虽然该工具只是预测Doublets，但是也不代表你可以没有重复性吧？

解决方案：

如果你想让自己的结果可重复，可以在以下函数加入set.seed()，这些函数分别是paramSweep_v3，parallel_paramSweep_v3，summarizeSweep。最好加在sample函数的前面。实测加了之后，结果就非常的可重复了。希望能帮你省点时间。

作者：POLLIGATOR
链接：https://www.jianshu.com/p/f08df3f8860e
来源：简书
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