2018-11.12-11.17
导读： 在单细胞技术出现之前，测序材料通常是数百万甚至更多细胞的混合DNA样本，这种方法虽然能够得到全基因组序列信息，但是对其进行研究得到的结果只是一群细胞中信号的平均值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，单个细胞独有的特性被忽视。另一方面，有些样品稀少无法在实验室培养，样品量不足以进行全基因组分析，例如肿瘤循环细胞、组织微阵列、早期发育的胚胎细胞等。这些都是全基因组测序遇到的难题。单细胞测序解决了用组织样本测序或样本少时无法解决的细胞异质性难题，为科学家研究解析单个细胞的行为、机制、与机体的关系等提供了新方向。因此，单细胞测序已逐渐成为科研热点。
单细胞测序：2013年最值得关注的测序技术
综述1 ：一层层揭开单细胞的面纱——从实验设计、实验条件和protocol的选择、到质控、数据分析和生物解释
文章题目： A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Med 2017 08 18 ;9(1)
1.为什么要做单细胞测序？
单细胞测序主要用于解决两个问题：
-
异质性（heterogeneity）
如，a）鉴定某些因为含量（比例）较低而在常规RNA测序检测时被“掩盖”的细胞亚群；
b) 检测细胞群体中不同的个体细胞：比如表达不同TCR的T细胞，胚胎发育早期的各个细胞等；
c）追踪某群细胞内细胞间的谱系（lineage）或发育关系； -
基因表达
获得每个细胞的基因表达、剪接模式、共表达网络等表达调控信息。
2. 单细胞测序的基本步骤是什么？
- 从组样品中分离细胞，包括显微切割和管理、流式细胞分选、微流控平台、微滴的方法（micro-dissection and manipulation,flow cytometric cell-sorting,microfluidic platforms, and droplet-based methods）
- 保留mRNA的裂解
- mRNA的捕获
- mRNA反转为cDNA
- cDNA的扩增
- 测序文库的制备
- cDNA文库混样
- 生物信息学工具进行质控和技术误差的评估
- 生物信息或计算方法解释数据背后的生物意义
单细胞测序的基本步骤
3. 单细胞测序的样本类型有哪些？
理论上说，任何的真核细胞都可以进行scRNA-seq检测。但在实际操作过程中，需要注意的是：1）从组织（特别是实体组织）中获得细胞的数量和活性；2） 在获取过程中人为操作对细胞转录组的影响，以避免出现人为因素的转录表达变化。当然从技术上说，除了分离单个细胞进行检测外，还可以直接分离细胞核（nuclei）进行测序。
4. 单细胞测序技术有哪些？
目前大约20多种scRNA-seq技术，每种技术也都有优缺点，选择哪种测序技术依赖于具体的科学问题。
- 首先需要考虑的是需要的数据类型。
如，对每个细胞的大量细节比较感兴趣，应该选择灵敏性高的方法，如SMART-seq2；如果是对可变剪切、或者全长转录本感兴趣，3‘-end的方法就不适合；如果是想从混合样本鉴定细胞类型，细胞量是关键，这个时候droplet-based的方法比较适合，因为在敏感性和成本上性价比较高。 - 不同的技术是如何计算评估技术变异的。常用的两种策略是“Spike-in”和“UMI”。
两者的定义：
Spike-in：分子或一系列分子被引入到样品用于校准测量和评估技术变化。
A molecule or a set of molecules introduced to the sample in order to calibrate measurements and account for technical variation; commonly used examples include external RNA control consortium (ERCC) controls (Ambion/Thermo Fisher Scientific) and Spike-in RNA variant control mixes (SIRVs, Lexogen)；
UMI（Unique molecular identifier） :特定的分子鉴定标签
A variation of barcoding, in which the RNA molecules to be amplified are tagged with random n-mer oligonucleotides. The number of distinct tags is designed to significantly exceed the number of copies of each transcript species to be amplified, resulting in uniquely tagged molecules, and allowing control for amplification biases.
单细胞测序技术
5. 需要测定的细胞数量以及测序深度该如何确定？
需要考虑的因素包括研究目的、细胞的异质性大小、平台和价格。
6. 单细胞RNA测序与常规RNA测序的区别是什么？
主要有三点：
1） 单细胞测序中某些低风度的转录本不能被检测到；
2）单细胞测序比常规测序的会有更高的技术误差（包括检测噪音等）；
3）单细胞测序检测的转录本量的分布上更加复杂，一般是符合负二项分布的，但也出现其它的分布，因此在选择统计方法时一定要特别注意。
7. 单细胞RNA测序的分析该如何做？
8. 单细胞RNA测序未来5年的前景如何？
主要包括几点：
1） 对检测细胞（样本）的要求降低：从新鲜细胞到冷冻保存的细胞；
2）性价比的提高：包括了平台技术的进步导致价格进一步降低和检测通量的增加：
3）对低丰度RNA检测的问题；
4）新的生信工具和软件的出现：后面我们会为大家介绍一个数据库——SCPortalen，来看别人的单细胞测序数据的挖掘使用。
5）与其它技术的联合：比如Crispr；
6）临床应用：按照这篇文章的观点，单细胞测序往临床上用的时间点大约在5年。
Glossary:
- Barcoding : 标记单个细胞或测序文库独特的寡核苷酸序列（即“条形码”），允许样本复用。最后用barcode信息对样本相关的测序reads去卷积。
- Dropout: 由于没有成功捕捉或扩增使转录本没有被检测到的事件。
- Spike-in：分子或一系列分子被引入到样品用于校准测量和评估技术变化。
- UMI：（Unique molecular identifier） :特定的分子鉴定标签。
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