文章导读
近日，上海交通大学瑞金医院呼吸与危重症医学科瞿介明教授、瑞金医院上海血液学研究所诸江教授和上海公共卫生临床中心卢洪洲教授合作在 Cell Research 发表题为Distinct immune signatures discriminate between asymptomatic and presymptomatic SARS-CoV-2 subjects 的论文。该研究通过整合质谱流式技术（CyTOF）、转录组测序（RNA-seq）和血浆微量蛋白的Olink检测技术，首次揭示区分持续无症状感染者和潜伏期无症状感染者的主要免疫学特征，并结合其临床特征，发现了影响SARS-CoV-2感染者在SSIS时期疾病朝不同方向进展的关键免疫机制，为临床工作中早期识别出潜伏期无症状感染者，以及在更早的阶段对其进行及时干预并阻断其进展为确诊患者提供理论依据。质谱流式（CyTOF）的抗体标记、生信分析由普罗亭完成。SARS-CoV-2感染后临床症状表现不一，越来越多感染人员处于SARS-CoV-2沉默感染阶段（SSIS），其中部分感染人员从核酸阳性到阴性，从始至终不出现相关临床症状表现，属于持续无症状感染者（persistently asymptomatic subjects），而部分感染人员在经过潜伏期后，随病程进展出现相关临床表现，属于潜伏期无症状感染者（presymptomatic subjects）。目前已有相关研究报道了COVID-19患者急性期（如轻症、普通型、重症和危重症）免疫反应特点。然而，对于SSIS阶段的感染者，为什么有些人会表现出临床症状，而有些人自始至终都不会？其中的免疫学特征知之甚少。因此，上海交通大学瑞金医院呼吸与危重症医学科瞿介明教授、瑞金医院上海血液学研究所诸江教授和上海公共卫生临床中心卢洪洲教授相关团队工作人员首次剖析了区分持续无症状感染者和潜伏期无症状感染者的主要免疫学特征，发现了影响SARS-CoV-2感染者在SSIS时期疾病朝不同方向进展的关键免疫机制。
文章研究思路
研究人员联合使用CyTOF、RNA-seq和OIink技术对年龄、性别相当，无明显免疫异常的并发症的19名持续无症状感染者、12名潜伏期无症状感染者、47名轻型或普通型COVID-19患者以及27名健康志愿者的外周血标本进行联合分析，揭示了可以区分持续无症状感染者和潜伏期无症状感染者特有的免疫学变化。
文章研究思路
CyTOF阐述持续无症状感染者和潜伏期无症状感染者淋巴细胞免疫图谱差异
利用CyTOF技术，研究人员通过38个免疫细胞表面分子标志物鉴定了包括NK细胞、CD3+T细胞、B细胞、树突状细胞、单核细胞和中性粒前体细胞在内的35个细胞亚群（Fig 2.a-b）。
研究发现与持续无症状感染者相比，潜伏期无症状感染者CD62Lhi CD8+ Tnaïve细胞比例明显下降，MAIT比例有下降趋势，而CD4+ CD161hi NKT细胞比例上升（Fig 2.e-g），这可能与细胞的过度活化有关；相较于健康对照组，持续无症状感染者CD8+ Tnaïve细胞和MAIT比例基本不变，边缘区B细胞亚群增多，NKT细胞亚群不变，淋巴细胞的CD44表达上调、PD-1表达下调（Fig.h-l），研究人员推测这种免疫应答模式可能有助于形成保护性免疫，避免出现免疫耗竭。
Fig.1 CyTOF剖析淋巴细胞组成
潜伏期无症状感染者具有单核细胞过度活化和分化阻滞特征
研究人员通过CyTOF对单核细胞亚群进一步研究，分析发现与健康对照组相比，潜伏期无症状感染者和轻型、普通型COVID-19患者的CD107alow经典型单核细胞、过渡型单核细胞和非经典型单核细胞减少，而持续无症状感染者只有中间型和非经典型单核细胞明显减少(Fig 2.c-e)。进一步分析发现CD107ahigh与CD107alow经典型单核细胞的比值在潜伏期无症状感染者和轻型、普通型COVID-19患者组别中相较于健康对照组和持续无症状感染者明显增高（Fig 2.e），两者比值增高反映单核细胞处于过度活化状态；此外，伪时间分析发现潜伏期无症状感染者CD107alow经典型单核细胞向过渡型和非经典型单核细胞分化受阻(Fig 2.f)。与持续无症状感染者相比，潜伏期无症状感染者存在单核细胞过度活化和分化阻滞的现象。
随后，研究人员进行分层聚类以进一步评估CD4+T细胞、CD8+T细胞和单核细胞亚群差异对区分不同感染人群的影响，研究发现CD107alo C-Mo, I-Mo and NC-Mo亚群之间存在强烈的正相关性，NKT（T15）亚群与CD107aloCMo、I-Mo、NC-Mo或CD8+Tnaïve簇（T04）之间具有负相关性（Fig 2.i-j）。这些研究结果表明，异常单核细胞激活和分化阻滞在构建特殊的免疫细胞成分改变模式中具有潜在作用，该模式可能预示区分SSIS的无症状持续感染和潜在感染患者。
Fig.2 单核细胞异常与各组的淋巴细胞改变有关
RNA-seq揭示新冠病毒感染后免疫改变的分子机制
随后研究人员通过RNA-seq技术，进一步验证了单核/巨噬细胞活化、分化和功能异常与处于SSIS感染者疾病进展方向密切相关。研究发现，单核/巨噬细胞的浸润、功能激活和分化潜能，NF-kB信号通路的活化，与持续无症状感染者正相关；而I型干扰素信号通路、病毒复制抑制、抗原提呈、TNF和IFNγ信号通路、免疫缺陷、淋巴细胞耗竭、NKT信号通路，以及SARS-CoV相关病毒的感染反应，与潜伏期无症状感染者显著正相关(Fig 3.b-g)。此外，与持续无症状感染者相比，潜伏期无症状感染者单核细胞/巨噬细胞和抗病毒功能相关基因FAM110B、PPP1R17、CTDSPL和NOX1表达下调。相比之下，I型干扰素刺激基因如XAF1、IFI44、IFI44L、LAMP3、RSAD2、MX1和USP18以及免疫抑制基因包括SPP1、UTS2、EGR3和P2RY6在潜伏期无症状感染者中显著上调（Fig 3.h-k）。值得注意的是，促炎基因如CCR5、PAK3和LPAR3在潜伏期无症状感染者中富集，而抗炎基因IL12B在持续无症状组中更富集，表明促炎基因激活和免疫抑制之间可能存在因果关系。
Fig.3 持续无症状感染者和潜伏期感染者PBMC相关信号通路功能差异
Olink技术检测新冠感染者外周血血浆蛋白
研究人员通过Olink技术系统检测了180种外周血血浆蛋白种类，以系统描述SARS-CoV-2感染者分泌的炎症因子。研究发现包括与单核细胞相关的MMP-1, CLEC4A, LY75和STC1在内共7种炎症因子在持续无症状感染者和潜伏期无感染者中存在差异（Fig 4.e-f）。
与持续无症状感染者不同的是，潜伏期无症状感染者中MMP-1水平较健康者增高，而STC1水平明显下降，对结果进行相关性分析后发现MMP-1与单核细胞功能标志物CLEC4A、LY75水平呈负相关；相反的，STC1与二者呈正相关（Fig 4.g-h）。此外，STC1与CD107alo C-Mo、I-Mo和NC-Mo单核细胞显著正相关（Fig 4.i-j）。这些研究表明STC1是限制单核细胞活化的关键因子之一，可以抑制MCP-1促进非经典型单核细胞活化和迁移的作用，同时也是MMP-1负调控因子。
Fig.4 SSIS患者血浆炎症因子的特征差异
区分持续无症状感染者和潜伏期无症状感染者的免疫特征
最后，研究人员利用ELISA实验进一步分析了两种关键因子STC1和MMP-1，研究发现SSIS感染者血浆中这两种因子水平可以较好的将两种无症状感染者区分开（Fig 5.d-f），帮助临床中早期识别出潜伏期无症状感染者，从而对患者进行及时干预，改变病程转归，减轻疾病严重程度，进一步降低死亡率。
Fig.5 区分分离SSIS期的免疫标记
总而言之，该研究聚焦目前广受关注的新冠无症状感染问题，通过对SSIS队列的研究，发现相较于持续无症状感染者，潜伏期无症状感染者外周免疫细胞中CD107alow经典型单核细胞、过渡型单核细胞、非经典型单核细胞以及CD62Lhi CD8+ Tnaïve细胞比例均下降，并且血浆蛋白中STC1也是减少的，而 CD4+ NKT细胞比例是上升的；进一步分析后还发现潜伏期无症状感染者存在单核细胞过度活化和分化抑制的现象，这一现象可能与淋巴细胞耗竭和免疫阻滞相关，揭示了导致SSIS两种截然不同的进展方向的免疫机制，有助于进一步了解SARS-CoV-2感染引起的免疫特征，为临床工作中早期识别出潜伏期无症状感染者，以及在更早的阶段对其进行及时干预并阻断其进展为确诊患者提供理论依据。
【参考文献】
Yu S, et al. Distinct immune signatures discriminate between asymptomatic and presymptomatic SARS-CoV-2pos subjects. Cell Res. 2021.
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41422-021-00562-1
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