Differential responses to kinase inhibition in FGFR2-addicted triple negative breast cancer cells: a quantitative phosphoproteomics study

FGFR2诱导的三阴性乳腺癌细胞对激酶抑制的差异反应：磷酸化蛋白质组学定量研究

期刊：Sci Rep. (IF = 4.29) 

发表单位：伯明翰大学

导 读

    该项研究中，采用差异磷酸化蛋白质组学方法来分析两个三阴性乳腺癌细胞系中FGFR激酶抑制作用对后续激酶依赖性磷酸化事件的影响，为FGFR2激酶启动的信号通路的结构提供了一个全面的视角，鉴定了药物依赖性的磷酸化事件，揭示了不同细胞系之间反应的共性和差异。

摘 要

成纤维细胞生长因子（FGF）依赖性信号通过多种不同机制在癌症中被激活，然而所涉及的下游信号转导途径仍不明确。本研究采用定量差异蛋白质组学方鉴定FGF调控的两个三阴性乳腺肿瘤细胞系MFM223和SUM52的磷酸化事件，这些细胞系表现出FGF受体2（FGFR2）的扩增表达并依赖于持续的FGFR2信号传导细胞活力。基因本体分析显示，SUM52细胞富含与细胞代谢相关的蛋白质，而MFM223细胞富含与细胞黏附和迁移相关的蛋白质。SU5402对FGFR2的抑制作用影响了这些细胞中观察到的磷酸化蛋白质组的很大一部分。FGF信号传导途径在结构上是灵活的，因为鉴定了RAF/MAPK/ERK/RSK和PI3K/AKT/PDK/mTOR/S6K途径中对FGFR2激酶活性的抑制。观察到磷酸化依赖性负反馈途径的抑制作用，定义了对FGFR2抑制的内在抗性机制。这些发现对于FGFR抑制剂的治疗应用具有意义，因为它们在具有相同遗传损伤和耐药性途径的细胞中鉴定出共同的和发散的响应。

前 言

    成纤维细胞生长因子（FGFs）是进化上保守的配体家族，在发育和分化、组织再生、血管发生、细胞迁移、细胞死亡和代谢调节等许多生物过程中起重要作用。许多形式的癌症都涉及FGF受体（FGFR）信号异常的表现，FGF的活性配体调节肿瘤/基质细胞相互作用，如血管生成、转移和免疫逃避。要提高FGFR抑制剂的临床疗效，需要更多研究了解FGF途径损伤对FGFR激酶依赖性信号传导的影响。

    该研究中，采用差异磷酸化蛋白质组学方法分析FGFR激酶抑制作用对后续激酶依赖性磷酸化事件的影响。用FGF刺激两个细胞系，并使用差异标记SILAC质谱技术分析处理过程中以及两个细胞系之间蛋白丰度的差异。这种方法为FGFR2激酶启动的信号通路的结构提供了一个全面的视角。

方 法

    在存在或不存在FGFR激酶抑制剂SU5402的情况下，FGF1诱导三阴性乳腺癌细胞系SUM52和MFM223中FGFR2的过表达后，进行细胞裂解和蛋白质测定。

    使用Perseus进行生物信息学分析，Student'st检验进行显著性检验计算蛋白差异，DAVID用于注释蛋白的GO功能，的KEA对包含定位良好的磷酸位的磷酸肽进行预测的激酶基序分析。

    更详细的材料和方法可以在在线补充材料中找到。

结 果

1  SUM52和MFM223细胞的蛋白质组学概况

    总共得到185655个非冗余肽段，映射到3659种蛋白质。SUM52细胞和MFM223细胞之间923种蛋白质的丰度显著不同，473个蛋白的在SUM52中高表达，450个蛋白在MFM223中高表达。SUM52中FGFR2的丰度高于MFM223，并通过蛋白质印迹法证实。（蛋白谱的全局概况显示，尽管这两个三阴性的FGFR2过表达细胞系均显示出对FGFR2激活的依赖，但是很明显它们响应的蛋白质组学情况不同，可能会影响其对抑制剂处理的整体反应）

    GO富集分析SUM52中高丰度的蛋白质富集代谢过程。几种糖酵解酶的丰度高于MFM223细胞，包括磷酸果糖激酶（PFKL）、三糖磷酸异构酶（TPI1）、甘油三磷酸脱氢酶（GAPDH）、磷酸甘油酸变位酶（PGAM1）、乳酸脱氢酶B（LDHB） 和6-磷酸葡萄糖1-脱氢酶（G6PD），表明SUM52细胞更依赖于代谢重编程来维持生存。MFM223细胞中高丰度的蛋白质参与细胞间粘附、蛋白质转运和肌动蛋白依赖性过程的蛋白质富集。许多这些增加的表达与增加的细胞运动性，癌细胞的侵入和不良预后相关（两个细胞系进行比较）。

图1，两种过量表达FGFR2的三阴性乳腺癌细胞系中的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学情况不同。（a）实验设计示意图；（b）SUM52和MFM223细胞系中差异蛋白；（c）蛋白质印迹分析；（d）SUM52和MFM223细胞系中差异化磷酸肽丰度；（e）SUM52和MFM223细胞中FGFR2肽的差异丰度。

2  SUM52和MFM223的磷酸化蛋白质组分析

    总共分析了79个肽级分，得到1929个独特的磷酸位点，映射到1130个独特的蛋白质上。SUM52细胞和MFM223细胞之间549种磷酸肽的丰度存在显著差异，396种在SUM52中更高，153种在MFM223中更高。（类似地，首先描述磷酸化蛋白质组全局概况，并在下文列举代表性的磷酸化位点比较两组细胞系的特征）

    FGFR2激活环酪氨酸Y656和Y657，这些位点上的FGFR2自磷酸化在SUM52中远远超过了相对蛋白水平，表明SUM52中FGFR2过表达与自磷酸化能力增强有关。

    MFM223中显著更高的双磷酸化肽是JunB磷酸肽T255S259。JunB上的T255和S259都是E3泛素连接酶SCFFBXW7识别的磷酸基序的一部分，JunB的泛素化导致蛋白酶体降解和JunB调控的转录活性的下调。因此，低的SUM52/MFM223比表明JunB在SUM52中比MFM223细胞更稳定（讨论JunB蛋白）。

    PIN4_Y122是SUM52中丰度明显高于MFM223的单磷酸化肽，其通过调节线粒体代谢与肿瘤存活相关联。在SUM52中比MFM223具有更高丰度的另一种磷酸肽是BAD_S99，可通过阻止BAD和抗凋亡BCL2蛋白之间的促凋亡相互作用来抑制凋亡，这可能表明控制细胞系之间凋亡的不同机制。（讨论PIN4，BAD蛋白）

3  磷酸化蛋白质组分析细胞对FGFR激酶抑制剂治疗的敏感性

    FGFR激酶抑制剂对FGFR2扩增的乳腺癌患者具有潜在治疗价值，但抑制作用的下游反应是未知的。FGFR抑制剂SU5402处理后MFM223和SUM52后，分析蛋白磷酸质谱。总共在2649个蛋白质上产生6574个独特的高可信度磷酸位点，以及SUM52中3082个磷酸肽和MFM223中2493个磷酸肽的定量数据。

    SU5402处理导致SUM52中的197个磷酸肽的丰度显著降低，21个上升；MFM223中157个降低，21个上升。两细胞系都存在大量对SU5402敏感的丝氨酸/苏氨酸磷酸化事件，表明丝氨酸/苏氨酸定向的激酶或磷酸酶传播了酪氨酸定向FGFR2激酶的下游事件。SUM52中共有218个磷酸化位点对SU5402敏感，在MFM223中有178个磷酸化位点，其中55个的磷酸酶在两种细胞系中均表现出相同的SU5402敏感性。两细胞系对SU5402敏感的磷酸化位点的差异突出显示了对FGFR2抑制的差异反应。

图2，SUM52和MFM223细胞中FGFR2活性的抑制导致磷酸化的多种变化。（a）实验设计示意图；（b）蛋白质印迹分析；（c）SU5402存在下测定细胞活力；（d）SUM52和MFM223细胞中共有的和不同的SU5402敏感性磷酸酯的数目。

4  基因本体和激酶富集分析（KEA）

    分析了含有SU5402敏感磷酸位点的蛋白质的功能，深入了解受FGFR2活性抑制作用的过程。采用了激酶富集分析（KEA），鉴定具有高活性的激酶。MFM223在MAP3K8（COT）和MAP2K1（MEK1）中得分最高，而SUM52在MTOR和SGK1方面得分最高。生物信息学分析的结果表明，两种细胞系均表现出不同的对SU5402反应的激酶活性库。（找到激酶与底物的关系，这里是简单讨论，没有较深的通路）

图3，预测不同的激酶对FGFR2抑制敏感，使用激酶富集分析工具KEA2搜索对SU5402处理敏感的磷酸化位点。

5  FGFR途径分析

    从数据中提取先前鉴定为与FGFR信号传导有关的蛋白质中的亚磷酸酯，以了解单个成分水平上的FGFR途径活性。使用iPTMnet数据资源分析了这些蛋白质上的单个磷酸位点，该数据源整合了文献汇编的激酶/底物磷酸化事件，并从功能未知的大规模蛋白质组学筛选中鉴定了磷酸位点。

    在后续的篇幅中，作者列举了大量的代表性磷酸位点，阐述其表达特征、磷酸化特征以及功能的关联。详见原文，此处略。

图4，对已知在FGFR2下游起作用的SU5402敏感性蛋白质。从数据集中提取属于已知在FGFR2激活下游受调控的蛋白质的磷酸肽，_1，单磷酸化的肽，_2，双磷酸化的肽。

6  共有磷酸位的差异磷酸化

    作者还创建了在两个细胞系中均鉴定出的1385个磷酸位点的数据库，并检查了两个细胞系之间的SILAC比值的差异，观察到SU5402在SUM52和MFM223中差异性地改变了特定的mTOR介导的信号传导和RAS/MEK/ERK事件。通过观察FGFR2诱导的SUM52和MFM223表型以及对SU5402的凋亡诱导作用，显示SU5402介导的凋亡涉及同时激活促凋亡和抑制抗凋亡功能。

图5，SU5402敏感磷酸位的差异调节。（a）绘制了在两种细胞系中鉴定的SU5402敏感的磷酸位点；（b）不同的SU5402敏感性的两种细胞系中鉴定出的磷酸位点中观察到的比率的差异，_1，单磷酸化的肽，_2，双磷酸化的肽；（c）观察到EIF4BP1磷酸肽的SU5402-敏感性差异。

讨 论

    这项研究着手确定受FGFR2激酶药理作用影响的蛋白质组学格局和磷酸化依赖性细胞内信号通路。它着重于两个三阴性乳腺肿瘤细胞系MFM223和SUM52，它们具有FGFR2基因和蛋白质高表达的共同特性，持续依赖FGFR2信号来维持细胞存活。目的是更好地理解癌症中对FGFR2活化的分子反应，并确定新的生物标记物和靶标，以更有效地利用针对抑制FGFR2信号转导的药物。使用差异磷酸化蛋白质组学方法，在219种对FGFR2激酶活性抑制敏感的蛋白质上确定了341个位点。数据扩展了FGFR2信号传导的已知领域并确定许多新目标，并观察到RAF/MEK/ERK/RSK、PI3K/AKT/PDK/mTOR/S6K途径受到抑制。通过专注于在两个细胞系中确定的磷酸化位点，还观察到在两个细胞系中对FGFR2抑制的响应存在显著差异。这些不是互斥的，因为在两种细胞系中两种途径的蛋白均被抑制。结论表明，FGF途径是一个动态系统，其行为由途径结构的定量和定性特征定义。此外，数据还提供了一个功能性磷蛋白生物标志物目录助于进一步分析和肿瘤分级。

点评：该文讨论了两个细胞系的蛋白组，磷酸化组实验。主要关注差异位点，差异蛋白的功能功能，重点差异蛋白涉及的功能。仍然是泛泛而谈，未能聚焦到特定的信号轴上。也没有找出某个新颖特定的蛋白磷酸化靶标位点。

    本文研究的是乳腺癌，乳腺癌有大量的公共数据，包括基因组，蛋白组，转录组，代谢等，如果可以进行比较分析，找出乳腺癌中的共性特性，突出FGFR2过表达后特有的变化，揭示一些规律，文章可以增色不少。