本期推送带来了斯坦福大学的Caleb Lareau博士在去年八月的全球虚拟癌症研讨会上分享的线粒体单细胞ATAC-seq (mtscATAC-seq) 的技术。该技术帮助Lareau博士通过克隆谱系追踪来评估驱动肿瘤进展、进化和转移的主要因素——肿瘤克隆异质性。
通过线粒体DNA了解肿瘤发生
“肿瘤形成在时空上是不连续的；是一个通过不同阶段不断推进的动态过程。”[1]1958年，英国癌症研究学院的Leslie Foulds博士提出了上面这样的观点，并建立了一种新的肿瘤发生模型。在该模型中，癌症不像以前推测的那样以规律的线性方式发展。相反，癌症起源于更复杂、更分散的路径[2]。时间来到20世纪70年代，研究人员又提出了一种由基因组不稳定性驱动的癌症进展的演化模型，从而导致异质性癌细胞从克隆起源分支出来[2]。
由基因突变驱动的肿瘤演化标准模型图片来源：Darryl Leja, NHGRI
而现在，这种异质性被认为在肿瘤进展、对治疗的不同反应和复发中发挥重要作用。根据Caswell和Swanton的说法，“深入了解单个肿瘤的克隆复杂性及其对肿瘤进展、免疫逃逸和衰竭的贡献，可能对开发更有效的癌症治疗方法至关重要”[2]。
但是，当变化的特征难以识别时，理解驱动肿瘤进展的细胞间变化就十分具有挑战了。研究人员利用基因突变来跟踪从最初的克隆到肿瘤生成的路径，包括拷贝数变异 (CNVs) 和单核苷酸变异 (SNVs) 。然而，Lareau博士在全球虚拟癌症研讨会上指出，这种方法在处理没有大量可检测的CNVs或SNVs的肿瘤时会失效。也正是这一挑战促使他的团队寻求其他方法来解构克隆谱系并揭示了肿瘤中的混合细胞群。
研究人员将体细胞线粒体DNA (mtDNA) 作为追踪肿瘤细胞克隆谱系的有效生物学参数。mtDNA在细胞分裂的每个周期中被传递给子细胞，并且被严重诱变，突变率是核基因组的10到100倍。因为每个细胞中有成百上千个mtDNA拷贝，所以确定的突变具有很高的可信度。这使得mtDNA在追踪细胞系中的体细胞突变方面非常具有价值。并且从实验的角度来看，mtDNA也很容易获得。此外，由于每个分子比核基因组小20万倍，对mtDNA进行测序的成本也不高。
Lareau博士还指出了使用mtDNA的另一个关键优势：它可以通过标准的染色质可及性实验方案进行测量。
“在ATAC-seq中，多达一半的读取将归因于线粒体DNA。这是因为线粒体DNA没有核小体或组蛋白，所以整个16.6kb的重叠群本质上是存在于细胞质中，在线粒体中，Tn5[转座酶]可以对其进行切割。这通常被认为是ATAC-seq中令人讨厌的一部分，但对于对测序线粒体DNA以创造深度感兴趣的人来说，这却是一个两全其美的方法，使用标准的ATAC-seq可以对线粒体DNA和可及性染色质进行非常深入的测序，实现细胞突变的评估以及推断细胞状态的特性。”Lareau博士解释说，凭借进行深度线粒体测序的能力，甚至可以检测到低频体细胞突变，这可能揭示克隆进化的隐藏驱动因素或导致异质性的少量不同肿瘤细胞。
单细胞ATAC-seq的样本准备
因为在谈到肿瘤异质性时每个细胞都很重要，所以线粒体DNA的单细胞视图对于Lareau博士的实验至关重要。因此他的团队选择进行10x Genomics Chromium Single Cell ATAC-seq测定，然而ATAC-seq需要单核作为样本输入，这意味着线粒体的丢失。
于是Lareau博士接下来的一个挑战就是开发一种方法，从而可以在基于液滴的单细胞ATAC-seq反应中保留细胞质及其内容物。样品制备和数据处理中的三项关键创新实现了这一设想。他们采用了一种改良的细胞裂解方案以保留mtDNA，增加了一个额外的固定步骤，并开发了一个新的计算框架来调用变体，包括频率较低的变体。这些创新实现了在单细胞分辨率下对整个线粒体染色体的几乎无偏的覆盖，从而获得更高的细胞通量和性能。
线粒体DNA --图片来源：NHGRI
当应用于慢性淋巴细胞白血病样本时，这种方法的优势也很明显。白血病患者外周血中的B细胞数量较多，这些B细胞通常共享一个主要的B细胞受体 (BCR) 序列。这是克隆扩张的标志，意味着组成肿瘤的大多数B细胞都是设定受体序列的初始克隆的子细胞。然而，Lareau博士想知道是否能在这些看似同质的B细胞中找到独特的亚克隆群。
对于一半的白血病样本，他们使用10xGenomics的5'单细胞RNA测序技术来测量单个细胞的基因表达和BCR序列。对于剩下的一半样本，他们利用改良的mtscATAC-seq实验方案来识别亚克隆线粒体DNA突变。特别是有一名患者，有十几个体细胞突变，使他们能够将B细胞聚集成9个独特的亚克隆。
“在发现这些突变后，我们有点想知道，这些被这些突变标记的肿瘤细胞是否有任何功能价值？”仔细观察他们对BCR序列和mtDNA突变进行测序的一组细胞，他们改进了潜在的亚克隆群体。虽然一些携带线粒体突变的亚克隆与大多数肿瘤具有相同的BCR序列，但一小群B细胞在14858G等位基因处共享一个突变并具有不同的BCR序列。
“这提供了一些全面的佐证，即DNA突变正在标记某种真正的、功能性的亚克隆，该亚克隆与肿瘤的其余部分具有非常不同的BCR序列。”
mtscATAC-seq解锁更大的多组学潜力
mtscATAC-seq提供了定义肿瘤中独特亚克隆的潜在生物学的高分辨率视图，通过解锁隐藏的肿瘤异质性，mtscac-seq有可能帮助科学家建立更全面的癌症知识。而这仅仅是个开始。新一代多组学的持续创新，即从同一单个细胞或组织切片同时捕获多个测量值，正在打开新的大门，使得科学家在同一实验中能够获得更多的分析数据。Lareau博士和该领域的其他领军人物，前纽约基因组中心的Eleni Mimitou和Peter Smibert共同开发了ASAP-seq（ATAC 与 Select Antigen Profiling bySequencing）。利用mtscATAC-seq所展示的方法改良，即增加额外的细胞固定步骤以保持蛋白质表达，ASAP-seq使科学家能够“收集染色质可及性、数百种细胞表面和细胞内蛋白质的丰度以及数千种细胞的mtDNA变体的信息。”[3]。不久之后，该团队还开发了DOGMA-seq，它利用来自10x Genomics的Chromium Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression从同一细胞中捕获更多信息层，即RNA。
参考文献：
[1]Foulds L. The natural history of cancer. J Chronic Dis 8: 2–37 (1958).
[2]Caswell DR and Swanton C. The role of tumour heterogeneity and clonal cooperativity in metastasis, immune evasion and clinical outcome. BMC Med 15: 133 (2017).
[3]Tang L, et al. Arsenal of single-cell multi-omics methods expanded. Nat Methods 18: 858 (2021).
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