关键词

SERS，LFIA，竞争法，AuNPs，普鲁士蓝，

文献信息

“Engineered Core–Shell Multifunctional Nano-Tracer in Raman-Silent Region with Highly Retained Affinity to Enhance Lateral Flow Immunoassays”

Small 2022, 2204859

DOI: 10.1002/smll.202204859

西农食品学院王建龙，张道宏，刘思杰

摘要

SERS与工程纳米示踪剂结合，LFIAs中提供了非凡的潜力。然而，SERS-LFIA的研究执行往往由于拉曼指纹图谱的复杂性和重叠以及纳米示踪剂对抗体的亲和干扰而受到影响。为解决这些关键问题，通过对SERS-LFIA进行改进的扩大粒径和涂层改性策略，制备了一种精确控制纳米核（AuNPs）尺寸和纳米壳（普鲁士蓝纳米材料）的工程核壳多功能纳米示踪剂（APNPs）。重要的是，这种纳米示踪剂展现出增强的偶联效率、高保留亲和力、增强的胶体稳定性、在沉默区（1800-2800 cm-1）独特的SERS信号（2156 cm-1）、同时具有高信噪比，这些都有利于提高分析性能。通过对莱克多巴胺（RAC）检测的概念验证，通过将APNPs与竞争型免疫反应相结合，证明了一种双模式LFIA，可协同扩大的颗粒尺寸和涂层修饰支持的比色/生物沉默拉曼双反应（称为ECCRD分析）。本研究可能有助于合理设计多功能纳米示踪剂，而ECCRD检测方法可扩展到环境监测和生物医学诊断中的广泛应用。

研究背景

作者提出一种扩大颗粒尺寸和涂层改性协同策略设计比色和生物沉默拉曼双反应LFIA（称为ECCRD化验），并展示其潜力通过采用莱克多巴胺（RAC）作为概念验证。如图1所示，采用放大AuNPs（L-AuNPs，通过种子生长策略制备）作为PBNPs原位生长的纳米核来制备APNPs。在本设计中，APNPs的整个粒径约为100 nm，这有利于显示出更好的灵敏度，避免了成本的增加，防止了精确度的降低。由于放大的AuNPs和包被的PBNPs的精确编码，以及PBNPs中简单的抗体功能和氰化物（CN）结构，合成的APNPs显示出增强的耦合效率，高度保留的亲和力，增强的胶体稳定性，以及沉默区独特的SERS信号。在ECCRD分析后，显示出较高的信号背景比（SBR）和令人满意的分析性能。

结果与讨论

1.APNPs的制备、表征和性能

以HAuCl4·3H2O、铁氰化钾和六水氯化铁（III）为原料，采用改良的增大颗粒尺寸和涂层改性策略，合成了具有典型核壳结构的APNPs（图1i）。

原理图.

SEM（图1a）显示了明显的核壳结构，在APNPs表面有一个清晰的PB层，这对沉默区存在的拉曼峰至关重要。STEM mapping表明了Au在核心（红色）上的分布，而Fe（黄色）和N（蓝色）都位于APNPs的表面。XRD显示APNPs的特征峰与纳米晶体AuNPs（JCPDS No.04-0784）和PBNPs的面心立方结构（JCPDS No.01-0239）的主峰一致（图1c）。这些结果表明，在AuNPs上成功地生长出了具有令人满意的结晶度的PBNPs纳米晶体。进一步用XPS光谱研究了APNPs的电子结构和表面成分。调查扫描谱（图1d）显示，APNPs和PBNPs均由C、N、O、Fe元素组成，而Au元素仅存在于APNPs中。从Fe 2p（图1e）、N 1s（图1f）的高分辨率XPS谱中，在AuNPs上基于PBNPs的壳通过Fe3+和[Fe(CN)6]4-的沉淀反应产生。制备的APNPs在~546和~700 nm处表现出较强的吸光度（图1g），这分别归因于AuNPs和PBNPs。与预期的一样，在图2h中，在整个光谱中，APNPs在2156 cm−1处有一个强烈的单峰，表明−CN−在拉曼沉默区域的拉曼活性。与传统的拉曼染料相比，APNPs可以成为低内源和/或外源干扰的理想候选染料。AuNPs、L-AuNPs和APNPs的zeta-电位的变化进一步证实了粒径的成功扩大和涂层改性（图1i）。逐步修饰导致zeta-电位逐渐增加，APNPs（−42.65 mV）转变为APNPs-AbRAC（−34.10 mV），表明APNPs与AbRAC之间可能存在静电吸附。

图1.

2.APNPs在LFIA中作为信号失踪剂的潜力评估

在LFIA中，信号失踪剂由个功能：偶联抗体；输出信号。尽管这种扩大颗粒尺寸和包被修饰的方法提供更好的信号响应和更高的摩尔消光系数，但其作为新型信号失踪剂的潜力仍需进一步验证。考虑到抗原抗体之间的亲和力（指抗体分子与抗原分子的抗原决定因子之间的相互作用力）是影响LFIA分析性能最重要参数之一，测定了AuNPs-Ab、L-AuNPs-Ab和APNPs-Ab的亲和常数（ka）和平衡解离常数（KD）（原理图1 ii）。由于不是所有添加的抗体都能被信号标签捕获，相应的统计误差会导致亲和参数不准确，因此首先测量信号标签的抗体结合效率。如图2 a所示，通过间接ELISA测量了OD450 nm与AbRAC浓度的回归方程，用已建立的ELISA测量了三种不同信号示踪剂的耦合效率，如图2 b-d所示。虽然所有三个示踪剂的抗体吸附能力随着抗体浓度的增加（5-25 µg mL−1）而增加，APNPs显示更高的抗体吸附能力（在20 µg AbRAC添加时结合17.83 µg）在标签浓度和抗体浓度用于LFIA，这促进抗体的有效吸附，从而避免可能浪费的核心试剂。从图2 e-h可以看出（ELISA），基于APNPs的探针（1.37×109 M−1）与天然AbRAC（1.44×109 M−1）大致相当，比基于L-AuNPs的探针（7.15×108 M−1）和基于AuNPs的探针（5.91×108 M−1）高约1个数量级。基于天然AbRAC、AuNPs-、L-AuNPs-和APNPs探针的KD值分别为4.0×10−10 M、6.55×10−10 M、5.14×10−10 M、2.69×10−10 M（图2 i-l）。

KD计算方法. Ka计算方法. 图2.

这些结果清楚地表明，基于APNPs探针对目标物具有高度保留结合能力（接近自然抗体的ka）（图3 a），KD值没有增加暗示APNPs保持自然抗体的免疫活性（图3 b），这是归因于合适的增加颗粒大小，并与先前报道的趋势。图3 c提供了更直观的证明，在添加相同的抗体获得近似相等的信号输出的前提下，AuNPs、L-AuNPs和APNPs-LFIA所需的抗体依次下降，这与计算数据趋势一致，表明相应的策略设计将提供更好的灵敏度。如图3 d-g的颜色和UV-vis光谱，即使用高浓度的氯化钠溶液处理，APNPs表现出轻微减少（相应的特征峰值的吸光度分别损失19.61%和13.06%）而L-AuNPs（损失73.84%）和AuNPs（损失34.27%）严重凝聚。

图3.

3.生物沉默拉曼响应在LFIA中的概念验证和可行性

得益于APNPs的无背景拉曼活性和基于APNPs的纳米探针高度保留的抗体亲和力，首次验证了生物沉默拉曼反应在LFIA系统中的概念验证和可行性。利用APNPs-LFIA，我们打算实现ECCRD检测用于RAC的检测（原理图1 iii），这依赖于APNPs在沉默区表现出的独特的拉曼峰，以及全抗原与靶标物之间对抗体的竞争性免疫反应所引起的信号变化。为了验证这一假设，作者比较了不同NC膜和拉曼分子的拉曼光谱。如图4 a、b所示，典型的NC膜和拉曼报告基因（化学结构如图4 c所示）在指纹区均表现出多个拉曼峰，而在沉默区几乎不存在信号。相反，APNPs拥有一个独特的拉曼光谱（图4 b的上行），它位于拉曼沉默区，避免了内源性生物分子的额外干扰和潜在的光谱重叠的问题。需要注意的是，几乎所有被测试的NC膜在T线中都显示出强信号，这意味着所建立的模型的适用性（图4 d）。考虑到PALL120在阳性和阴性检测之间存在较大的差异值（D值）（这意味着具有更好的分析性能），作者选择PALL120来评价APNPs-LFIA的分析性能。

如原理图所示，设计用于RAC敏感监测的APNPs-LFIA的原理依赖于竞争型免疫分析格式。阴性条件下，T线呈蓝紫色，因此在T线中发现了大量的APNPs（见图4 e中的照片和SEM图像）。阳性条件下，T线呈无色状态，T线中未发现APNPs（见图4 f中的照片和SEM图像）。因此，APNPs-AbRAC探针将根据RAC的浓度变化提供相应的比色信号，并利用APNPs独特的拉曼信号，可以在LFIA系统中实现基于生物沉默区的信号测定。上述数据证实了一种涉及生物沉默拉曼响应的方案，可用于设计高灵敏度的ECCRD检测。

图4.

4.APNPs-LFIA在ECCRD分析中的应用

在最佳条件下，通过APNPs-LFIA、AuNPs-LFIA和L-AuNPs-LFIA对不同浓度（0-9 ng mL−1）的RAC标准品进行分析。在定性检测中，截止值（COV）定义为T线消失时RAC的最低浓度，检测视限（vLOD）定义为明显低于阴性结果的RAC最低浓度。不同RAC浓度下的反应带照片见图5 a c e。对于基于肉眼的定性分析，APNP-LFIA的vLOD为0.4 ng mL−1，是AuNPs-LFIA（vLOD：0.75 ng mL−1）和L-AuNP-LFIA（vLOD：0.75 ng mL−1）的1.875倍。APNP-LFIA的COV为1.75 ng mL−1，分别为AuNPs-LFIA（COV：9 ng mL−1）和L-AuNP-LFIA（COV：6 ng mL−1）的5.14倍和3.43倍。对于半定量分析，绘制信号强度与RAC浓度的曲线，提供了三种类型LFIAs的检测结果的描述。从图5 b d f 可以看出，三种LFIA的光强度和RAC浓度之间存在线性关系。其中，APNP-LFIA的最低LOD值（IC10）0.123 ng mL−1，约是L-AuNPs-LFIA和AuNPs-LFIA的1.08和1.59倍。这些结果证实，与APNPs和L-AuNPs相比，APNPs具有更好的分析性能，这是因为APNPs有更大的粒径，且APNPs-Ab对抗原的亲和力更好。

为进一步验证APNP-LFIA的优越性，还开发了双信号响应（比色和拉曼）进行比较，其中拉曼信号是由APNPs中CN拉伸的拉曼主动模式产生的。从图5 g（右）中可以看出，在拉曼沉默区只捕获了尖锐的拉曼带（2156 cm−1），与预期一致。每个APNP-LFIA的这些独特峰的拉曼强度随着RAC浓度的增加而降低（图5 h i），表明额外的信号响应与浓度依赖的半定量响应关系相一致。此外，拉曼响应的LOD值下降到0.080 ng mL−1，相对于APNP-LFIA的比色反应模式和视觉判断中，检测灵敏度较于IC10、vLOD和COV分别增加了1.58倍、5倍和21.8倍，较于L-AuNPs-LFIA分别提高了1.66，9.38和75倍，较于AuNPs-LFIA分别提高了2.44，9.38，和112.5倍。这些结果表明，可以在AuNPs表面同时扩大尺寸和修饰普鲁士蓝壳，以增强其光学特性，提供额外的信号响应，从而通过结合拉曼分析过程提高双响应LFIA的灵敏度。通过测定阴性样品和浓度特异性（1.0 ng mL−1）RAC样品的批间测定和变异系数（CV），评估了APNPs-LFIA的精度和准确性。从图5 j可以看出，各组检测间的CV在6.24%到10.13%之间，表明RAC监测的精度和准确性是可以接受的。

图5.

研究结论

作者成功地制备了一种基于比色和生物沉默拉曼双响应机制的创新的ECCRD检测方法。由于扩大粒径和涂层修饰策略的协同作用，作为信号示踪剂的APNPs表现出增强的抗体偶联效率，抑制抗体亲和干扰，增强胶体稳定性，并在沉默区具有独特的SERS信号。此外，这种独特的拉曼信号消除了内源性生物分子的光谱重叠和额外干扰问题，这是基于指纹区域的拉曼分析中普遍存在的问题。以RAC作为模型分析物，研究并验证了ECCRD检测方法的性能。利用合理的设计和伴随的优点，APNAs-LFIA平台介导的ECCRD分析的LOD为0.08 ng mL−1，与其他三个对照组的单独比色反应模式、L-AuNPs-LFIA和AuNPs LFIA相比，灵敏度有了令人满意的提高。鉴于更高的灵敏度和独特的双反应分析， ECCRD检测可以进一步扩大用于临床诊断和环境监测等。