Proteome-centric cross-omics characterization and integrated network analyses of triple-negative breast cancer
以蛋白质组为中心的三阴性乳腺癌的交叉组学特征和综合网络分析
发表期刊：Cell Rep
发表日期：2022 Mar 1
DOI: 10.1016/j.celrep.2022.110460
期刊相关信息
一、背景
三阴性乳腺癌（TNBC）占所有乳腺癌的10%-20%，其特征是肿瘤细胞上雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）在肿瘤细胞上的阴性表达。它表现出极大的肿瘤异质性，转移发生率最高，是所有类型乳腺肿瘤中总生存率最差的。人们已经努力将异质性的TNBC划分为分子亚型，希望发现药物靶点，从而形成有意义的临床干预方案。
二、材料与方法
1.数据来源
1） 共90份TNBC样本来自复旦大学上海肿瘤中心（FUSCC，80名患者有CNA数据，73名患者有WES数据，89名患者有RNA-seq数据，89名患者中有59名有配对的肿瘤和NAT测序）
2） 人乳腺癌MFM223、HCC1143、HCC38、HCC1937、HCC70、MDA-MB-157、MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-453、MDA-MB-468、HS578T和BT549细胞系
2.实验流程
1） 用于MS分析的蛋白质组学方法：蛋白质提取、TFRE剥离和胰蛋白酶消化、磷酸化肽的富集、LC-MS/MS分析
2） 蛋白质组数据分析：蛋白质/磷酸化位点/DBP鉴定和量化、LC-MS/MS数据的质量控制和评估、蛋白质组学数据集的预处理
3） 差异表达分析：软件包limma
4） 蛋白质组谱系数据的聚类：对82个肿瘤样本中至少有25%有效值的4079个蛋白质的表达矩阵进行了R软件包ConsensusClusterPlus中实现的无监督聚类方法
5） 磷酸化蛋白组数据的聚类：对于基于磷酸化位点、磷酸化蛋白，进行共识聚类；对于基于富集途径的聚类，1548种磷酸化蛋白的丰度矩阵进行单样本基因组富集分析（ssGSEA），在R软件包GSVA中实现，进行共识聚类。
6） DBP数据集的聚类：74个肿瘤样本中至少有1/3有效值的1279个蛋白质的表达矩阵被R软件包ConsensusClusterPlus用于无监督聚类
7） 蛋白质组和磷酸化蛋白组数据的整合聚类：综合聚类分析使用R/Bioconductor软件包iClusterPlus中实现的iClusterBayes方法进行，iClusterBayes适合贝叶斯潜变量模型，根据不同数据类型的联合推理生成综合聚类分配，并确定有助于聚类的特征
8） 亚型特征蛋白和磷酸化位点的鉴定：用R软件包limma进行差异表达分析，将每个亚型的蛋白和磷酸化位点丰度与其他亚型和NAT组的蛋白和磷酸化位点丰度进行比较
9） 亚型签名的基因集富集分析：分别用R/Bioconductor软件包GSVA中的 "gsva "功能与 "ssgsea "方法分析了亚型特征蛋白和通过磷酸化位点平均丰度估算的磷酸化蛋白
10）蛋白质组亚群与临床结果之间的关系：生存分析
11）TF活性和TF主调节器（MRs）的推断：为了从每个样本（肿瘤和NAT）的基因表达数据中推断TF活性，使用R软件包Viper中实现的基于分析等级的富集分析方法计算每个样本的富集测试
12）激酶活性和激酶MRs的推断：激酶底物富集分析（KSEA）由R软件包KSEAapp和PhosMap进行
13）基因组MRs的推断：具有明显突变或高度改变的CNA的基因被定义为基因组MRs
14）构建支架网络和标志物富集分析：461个MR基因组事件、499个MR TFs和52个MR激酶以及一个背景癌症相关网络被提交给TieDIE算法以生成TNBC的支架网络
15）病人特定网络的生成：为了生成特定样本的网络，选择了66名有配对肿瘤和NAT的患者，患者特异性网络被定义为支架网络的一个子集
16）共表达网络的构建：分别对蛋白质组（在至少25%的肿瘤中鉴定的蛋白质）、磷酸化蛋白组（在至少20%的肿瘤中鉴定的磷酸化位点）、DBP（在至少30%的肿瘤中鉴定的DBP）和转录组（在至少50%的肿瘤中鉴定的转录本）的肿瘤数据集进行皮尔森相关分析，然后合并构建多组学协同表达网络
17）群体检测和群体相互作用：然后通过社区检测算法infomap对这个整合的共表达网络进行聚类，以发现多组学水平上的分子之间的关联（
18）体外细胞存活率测定、蛋白质印迹法
三、实验结果
01 - TNBC样本和组学数据集的概述
90名患者的肿瘤和配对的非癌性邻近组织（NAT）样本从先前描述的FUSCCTNBC队列中收集。对样本进行了基于质谱（MS）的无标签蛋白质组学分析。对89个肿瘤和71个配对的NATs进行了全蛋白组分析，88个肿瘤和72个配对的NATs进行了磷酸化蛋白组分析，通过共识转录因子反应元件串联阵列（catTFRE）从78个肿瘤和60个配对的NATs样本中收集DNA结合蛋白（DBPs）进行MS/MS分析（图1A和S1A）。应用双组分高斯混合模型评估所有样品（肿瘤和NAT）在蛋白质组、磷酸化蛋白组和DBP分析中是否有足够的识别/定量，不满足标准的样品被排除在进一步分析之外（图S1B-S1D）。因此，从82个肿瘤和66个配对的NATs的全球蛋白质组分析中共获得了7531个蛋白质，从86个肿瘤和70个配对的NATs的磷酸化蛋白组分析中共获得了4194个蛋白质上的2069个磷酸基点，而catTFRE分析从74个肿瘤和57个配对的NATs中共获得了2967个DBPs（图S1E）。
研究中包括的非蛋白质组数据集是来自队列中73个全外显子组测序（WES）和80个拷贝数改变（CNA）的肿瘤样本，以及来自先前FUSCC研究的89个肿瘤和59个配对NAT的RNA测序数据集。
图S1 实验工作流程和样品质量控制
一些一般的数据特征显示如下：肿瘤样本显示的蛋白质/磷脂酶/DBP鉴定比NAT的多出约2倍，唯一鉴定的蛋白质几乎全部显示在肿瘤中（图1B-1D）；观察到1982个蛋白质、1889个磷脂酶和944个DBP上调；165个蛋白质、136个磷酸基点和91个DBPs显示为下调。这三个数据集的主成分分析显示了肿瘤和NATs之间不同的蛋白质组谱，在肿瘤中观察到的异质性程度高于NATs。
图1 TNBC的多组学数据概览
02 - TNBC单个蛋白质组学数据类型的聚类分析
首先对蛋白质和磷酸化蛋白表达数据集进行了肿瘤的独立共识聚类分析，由此得到四个聚类，分别命名为PPr1-4和PPh1-4。发现很大一部分肿瘤样本在相应的聚类集之间有重叠，其中67%的聚类PPr-1样本在聚类PPh-1中，74%的聚类PPr-2样本在聚类PPh-2中，64%的聚类PPr-3样本在聚类PPh-3中，而81%的聚类PPr-4样本在聚类PPh-4中。K-M分析表明，蛋白质组和磷酸化蛋白组集群都与疾病预后相关（图S4B和S4I），其中PPr-2和PPh-2都显示出较低的无复发生存率（RFS）。这两个基于单蛋白质组的簇集的高度一致性使我们相信蛋白质和磷酸化蛋白表达模式可能具有内在关联性，反映两者的统一蛋白质组亚型集可以通过蛋白质组的综合分析产生，并且所得亚型将更接近样品中蛋白质组的生物学表现，并且在使用中更实用。
DBP数据集未包含在综合亚型分析中，因为与其他两个蛋白质组数据集相比，发现的样本更少，集群更稀疏和不协调（图S4C）。此外，通过单样本基因组富集分析（ssGSEA）对磷酸化蛋白组数据集（图S4D）以及磷脂（图S4F）进行无监督聚类，将肿瘤分层为四个集群，分别命名为Ppath-1-4和Psite-1-4。Ppath-2（图S4E）和Psite-2（图S4G）都与预后不良有关。尽管三种类型的磷酸化蛋白组聚类显示了类似的模式，但选择PPh-1-4作为磷酸化蛋白组的代表聚类，以满足iCluster算法对相同输入特征类型的综合聚类分析的要求。
图S4 来自单一全能数据集的蛋白质组集群
03 - 综合性的TNBC蛋白质组亚型及其蛋白质/通路特征
通过使用iClusterPlus进行整合聚类分析，以产生一个亚型集，肿瘤样本被分层为四个蛋白质组亚型（表示为iP-1-4）（图2A和S5A），这些亚型在预后方面表现出明显的差异（图2B）。淋巴结等级以及肿瘤大小程度，在单变量cox分析中显示与患者生存有明显相关性。然而，调整了这些混杂因素（淋巴结等级和肿瘤大小程度）后的多变量cox分析显示，iP-2亚型不是患者生存的独立预测因素。与其他亚型相比，iP-2亚型的患者还显示出最短的生存期、较高的淋巴结等级和较大的患者年龄（图S5B）。
通过比较一个亚型中样本表达的全局蛋白和磷酸化蛋白与其他三个亚型及其配对的NATs，共获得794个全局蛋白和545个磷酸化蛋白（800个磷酸化位点）作为跨亚型特征蛋白，GSVA富集分析显示了每个亚型富集的不同途径（图2A）。在iP-1亚型中，高度富集的途径包括细胞周期、DNA复制和延伸、mRNA剪接，以及那些与E2F、MYC和BRCA有关的途径，表明iP-1亚型具有很强的增殖特征，如图2C所示，NAE1与正风险比有关。观察到特征性的雄激素受体（AR）信号和脂质代谢途径在iP-2中高度富集，类似于以前报道的LAR亚型转录组研究的模式。iP-2亚型的其他发现包括强烈的氨基酸代谢，以及上调的AR靶点和辅助因子DHCR24、ALCAM和FASN，显示与不良预后相关（图2C）。iP-3亚型呈现出免疫相关途径的高度富集，包括炎症、干扰素、细胞表面整合和TNF-α信号，表明该亚型有强烈的免疫细胞浸润。CDS2和TNFAIP2在iP-3亚型中被发现为特征蛋白。亚型iP-4表现出上调的ECM，上皮间充质和可能参与肿瘤转移的母体过程，确定的相关特征蛋白包括CTSG、MMP2、SERPINA5。通过Western blot（图2D）验证了一些特征蛋白在不同亚型中的表达，其中DHCR24和FASN在iP-2亚型中表达较高，NAE1和STAT1分别在iP-1和iP-3亚型中表达相对较高。
图2 综合性的蛋白质组学亚型
激酶和转录因子（TFs）是细胞信号转导的关键调节器。为了研究TNBC不同的基于蛋白质组的亚型中的激酶和TF调节模式，作者通过使用磷酸化蛋白组数据集推断单样本激酶活性，通过使用转录组数据集推断TF活性。每个亚型的推断活性增加的激酶是（图3A）：iP-1：CDK1和VRK1；iP-2：AKT1和MAP2K4；iP-3：PKN1和PRKD2。值得一提的是，MAP2K4，一个在iP-2中推断活性高度增加的激酶，参与了各种各样的细胞过程，在转录组中被观察到下调，但在蛋白质组中明显上调。通过DBP和/或磷酸化蛋白组数据集中TFs的表达水平对推断的活性增加进行了交叉检验（图3B）。结果，E2F1、CDC5L、HMGXB4、PHF5A、TFAM和UBP1在亚型iP-1中显示出更高的活性，这可以调节301个下游亚型iP-1特征中的175个。其中，E2F1已知可介导多个癌症标志过程，其靶基因产物CDK1、CDKN2A、TOP1、TOP2A和DNMT1，已知参与细胞周期、DNA修复和DNA甲基化过程，在亚型iP-1中被视为特别上调。在iP-2亚型中，发现AR和SREBF1的活性增加。SREBF1是AR的靶点，调节FASN、HMGCS1和ACACA等参与脂肪酸代谢的分子。至于iP-3亚型，ARID3A和STAT家族，先前报道参与各种免疫相关过程，在蛋白质组或磷酸化蛋白组中显示出较高的活性和表达水平。这些推断的激酶和TF活性分析的结果与不同的全息数据的特征蛋白和在各自的iCluster亚型中发现的路径很一致。
作者根据mRNA分析（FUSCC）和代谢途径分析（MPS），将综合亚型与之前定义的TNBCs分子亚型进行比较。比较结果显示，在iP-1和iP-2亚型中发现的大多数肿瘤样本也分别聚集在FUSCC亚型BLIS（88%）和LAR（60%）以及代谢亚型MPS2（82%）和MPS1（60%）中（图3C）。iP-3亚型中55%的肿瘤样本相应地被映射到FUSCC亚型IM，而35%（7例）的iP-3样本被映射到BLIS亚型，因为在这些样本中没有观察到免疫相关蛋白在转录水平的高表达（图S5C和S5D）。iP-4亚型的肿瘤样本被映射到更多样化的转录组和代谢亚型。这种比较表明，虽然基于各种方法的分子亚型有助于挤出TNBC的异质性，但基于蛋白质组的亚型更擅长于将 "特征"分子固定在更接近系统的作用上。在蛋白质组亚型与Lehmann分类的比较中发现了更多不同的样本分布（图3C）。
图S5 综合性的亚型
肿瘤样本的基因组数据集被用来探索任何可能的特征性基因改变，这些改变可以追溯到不同的iCluster亚型（图3D）。肿瘤基因TP53被发现是样本中最频繁的突变。在iP-2亚型中高度富集的基因突变出现在-AKT途径的基因上（iP-2为67%，其他亚型为28%），特别是基因PIK3CA（iP-2为44.4%，其他亚型为10.3%），意味着PI3K-AKT途径在iP-2肿瘤中发生了明显改变（图3D和S5E）。
图3 综合性蛋白组亚型的特征描述
04 - TNBC支架网络和优先治疗的主调节器
采用计算管道，通过整合主调节器（MR，包括激酶、TF和基因组改变，分别来自磷酸化蛋白组、转录组和基因组数据集的异常事件或改变的活动）和TieDIE算法建立TNBC支架网络。结果支架网络由396个节点（包括84个TFs和84个激酶）和2617条边组成，该网络中的节点富集了参与许多癌症标志途径的基因。参与e thPI3K-AKT-mTOR信号通路、性激素反应、细胞周期、DNA修复以及免疫和迁移途径的蛋白质富集度较高（图4A），与上述综合蛋白质组学分析的亚型特异性特征相对应。
图4 集成的TNBC支架网络和优先考虑的激酶作为推定的目标
然后将患者特有的基因组、转录和磷酸化水平的改变叠加到支架网络上，生成患者特有的网络（PSN）。作为TNBC支架网络中的关键调控者，每个激酶的治疗潜力通过对推断的激酶活性、蛋白丰度变化和网络连接性的病人特异性证据的组合贡献进行评分来确定优先次序（图4B）。得分最高的激酶中的激酶底物调控层次被提取出来，显示在图4C。这个层次结构可以用来优先考虑将激酶作为潜在的药物靶点，基于这样的假设：越多的靶点被激酶磷酸化，越多的基因产物和它们的活性可以被改变，因此它拥有的有效治疗潜力越大。因此，AKT1在iP-2亚型中表现出较高的治疗目标潜力得分。AKT1可能负责TFs和激酶的磷酸化，如FOXO1、FOXO3、DNMT1、KDM5A、MTOR、BRAF、GSK3A、PRKCD和RAF1（图S6A，S6E和S6F）。PRKCD和SRC参与PI3K-AKT-mTOR信号传导途径。PRKCD（图S6D和S6E）对iP-2和iP-3两种亚型显示出类似的潜在得分，而SRC没有显示出亚型特异的得分分布。CSNK1A1和PRKCB（图S6B、S6C和S6E）可以分别成为iP-1和iP-3亚型的潜在目标。PRKCD、CSNK1A1和PRKCB被显示为下游调节几个TFs和激酶（图S6G-S6I）。其他具有高治疗潜力的激酶，如MAPK1和MAPK14，没有显示出亚型偏见，表明针对这些蛋白的干预可能会对所有TNBC患者产生类似的效果。总之，从支架和患者特定网络分析中得到的分级优先主调节器是发现TNBC治疗目标的分子库的一个宝贵部分。
图S6 作为潜在治疗目标的优先激酶
05 - 共表达网络和交叉组学群体提供了一个TNBC的整体分子视图
分子共表达模式提供了不同类型的分子或细胞事件如何在生物系统中相互作用和共同调控的整体观点。共表达网络的分子模块（社区）是由社区检测算法infomap发现的，构建了一个总共有151个群落（≥10个节点/群落）的网络。一些群落由来自单一全能型的边缘主导，而其他群落则由多分子层的边缘组成，意味着不同分子维度的调控行为（图5A和S7A）。作为分子库的一部分，这是对TNBC进行系统研究的一个有价值的基础设施，同时还有来自本研究其他分析的分子、路径和网络。
通过对社区内的分子进行基因集富集分析（GSEA），发现聚集在同一社区的基因产品和/或事件倾向于具有共同的功能。一些群落显示出的分子/途径特征与之前的综合亚型分析高度一致。C12群落富含参与细胞周期和转录的基因产物/事件，也是本研究中确定的iP-1亚型的特征（图5B和S7B）。社区中的85个基因中有6个是iP-1亚型的标志性蛋白，10个在iP-1中的磷酸化位点增加。其中，TOP2A既被鉴定为亚型iP-1的标志性蛋白，又被鉴定为亚型iP-1的磷酸化蛋白，是该社群中连接度最高的节点。C13群落（图5B和S7C）富含参与脂质代谢途径（胆固醇和脂肪酸的生物合成以及SREBP调控基因表达的激活）的基因（100个基因中的47个）。21个节点被确定为iP-2亚型的特征，其中FASN是这个群体的中心基因之一。另一方面，社区C10（图5B和S7D）可以被描述为一个免疫相关的社区。这个群体中108个基因中有42个涉及免疫系统，其中10个是iP-3亚型的特征。其他群落显示了各种过程和途径的富集，这些过程和途径有助于维持基本的细胞功能，以及发挥连接群落的作用，形成网络骨干。其他过程偏重的群落包括参与细胞周期（群落C30）、翻译启动（C34）、转录调节（C35）、翻译后修饰（C55-C57）、蛋白质和糖脂代谢（C55，C140）、神经递质释放周期（C94）和昼夜钟（C116）（图S7E）。
图5 多组学共表达网络中的群体检测
图S7 共同表达网络和网络社区的工作流程
06 - NAE1被发现为iP-1亚型的药物靶点
通过对TF主调控因子的检查，发现NAE1是iP-1亚型的标志性蛋白，受转录因子UBP1、TFAM、CDC5L和HMGXB4的调控，在该亚型中表现为活性和表达升高（图6A）。共同表达分析表明，NAE1的丰度与TF主调控因子UBP1和其他iP-1标志蛋白明显相关（图6A）。在临床上，NAE1被证明与预后不良有关（图6B）。多变量cox分析，在调整了淋巴结等级和肿瘤大小程度后，显示NAE1是患者生存的独立预测因素。
然后选择NAE1，通过使用NAE抑制剂MLN4924治疗人类TNBC细胞系来评估其治疗潜力。12个人类TNBC细胞系根据其NAE1蛋白水平，如通过Western blot测量，被分为NAE1高（HCC1143，HCC1937，HCC38，HCC70，MDA-MB-453，MDA-MB-436）、NAE1中度（MDA-MB-468，HS578T，BT549）和NAE1低（MFM223，MDA-MB-157，MDA-MB-231）组（图6C）。MLN4924（pevonedistat）是一种小分子的神经前体细胞表达，NEDD8、激活酶（NAE）的抑制剂。为了确定NAE1蛋白表达水平是否与NAE1高组和NAE1低组细胞系对MLN4924治疗的敏感性相关，作者测量了用九种不同浓度的MLN4924治疗的细胞系的生存能力。结果显示，以半最大抑制浓度（IC50）值衡量的细胞活力，在NAE1高组的细胞系中明显降低，而NAE1低组对该处理的敏感性明显降低（图6D）。通过Spearman等级相关分析，进一步说明了细胞系中NAE1的表达与IC50值之间存在明显的负相关（图6E）。菌落形成试验证实了这一发现，与NAE1低的细胞（MDA-MB-231和MDA-MB-157）相比，NAE1高的细胞系（HCC38和HCC1143）的相对菌落数明显减少（图6F）。总之，实验和分析结果有力地证明了NAE1是MLN4924对iP-1亚型TNBC患者的一个有希望的治疗靶点。
图6 NAE1是 "iP-1 "的推定药物靶标
07 - iP-2亚型的可行治疗目标：脂肪酸代谢的关键分子
本研究中不同的分析证据一致认为，在TNBC的iP-2亚型中，脂质/脂肪酸相关的事件发生异常。综合蛋白质组亚型分析显示，脂质代谢途径在iP-2中高度富集，其中SREBF1调节和脂肪酸代谢相关的蛋白质如FASN、HMGCS1和ACACA上调；激酶AKT1在蛋白质组和磷酸化蛋白组中都高度表达，并且根据磷酸化蛋白组数据集推断出激酶活性增加。AKT1在iP-2亚型中的意义在支架网络分析中得到了证实，通过支架网络分析，PI3K-AKT通路明显富集，AKT1被列为该通路中高度优先的激酶主调节器，因为它在PSN中显示出强大的连接性，以及其高激酶活性和蛋白丰度。在共表达群落网络分析中，发现C13群落与广泛的脂质相关途径富集。通过将重要的交叉组学关联纳入网络，C13被证明与C54（ACAA1）、C67（PPT1、ELOVL1）和C73（ACACA、CRAT）中的分子发挥了强有力的连接作用，通过其关键分子，如FASN、ACLY、HMGCS1和IDH1在过氧体的脂肪酸合成和β-氧化/代谢过程中发挥了作用。C13中的MDH2也被证明与C54中的IDH2有交集；两者都参与TCA，可能也参与线粒体中的β-氧化过程（图7A和7B）。
图7 TNBC的iP-2亚型中新的脂肪酸代谢上调
作为一个优先的激酶主调节器，AKT1可以通过PI3K被激活，随后通过上调一系列下游分子如ACLY、SREBF1、FASN和ACACA促进新的脂质合成。有趣的是，在iP-2亚型样本中观察到脂肪酸转运蛋白如CD36、FABP5和LPL都下调，这表明TNBC细胞中脂肪酸的供应主要来自异常的新生脂肪生成，而不是iP-2亚型的外源性摄取。正如图7B所总结的，脂肪酸代谢过程的改变是亚型iP-2的特征。参与这些过程的关键蛋白的表达或/和活性的上调/下调，形成了发现该亚型药物的合理目标库。本研究结果意味着受AR调控的特征蛋白可以成为更有效治疗疾病的候选目标。该靶点库还可用于指导开发更有效和有针对性的蛋白酶抑制剂Cocktail，对于那些在不同阶段的临床试验中显示出一定水平或有限的独立治疗效果的，如AKT1、FASN、PI3Ks、AR和ACAA1。
四、结论
本研究报告的综合蛋白质组亚型通过整合蛋白质组和磷酸化蛋白质组与临床表型相关的定量组成来描绘TNBC异质性，揭示了明显的亚型特异性信号通路，代谢重编程和特征调节因子，这些调节因子强调了亚型的分子特征。亚型iP-1以其途径和特征蛋白（如TOP2A，CSNK1A1和NAE1）表现出很强的增殖特征。亚型iP-2预后不良与亚型中特征性脂质代谢途径密切相关，尤其是脂肪酸合成途径，其中PI3K途径是一种主要的信号级联反应，有助于Warburg效应并增强脂质合成，由于途径中高度突变的基因而被激活。亚型iP-3的特征在于免疫过程的高富集。在亚型iP-4中，上皮-间充质通路中可能与肿瘤转移相关的分子被簇拥在一起。蛋白质组亚型与其他数据类型的比较显示出明显的差异，尽管转录组和代谢亚型的BLIS和MPS2与 iP-1 有明显的相似之处。通过亚型分析和网络分析，提出了潜在的治疗目标，并通过实验或文献回顾进行验证。
网友评论